化痰祛湿活血方对非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型ADPN/PI3K/AKT通路关键蛋白的影响

张丽慧， 张剑波， 赵文霞

河南中医药大学第一附属医院， 郑州 450000

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指无过量饮酒史、以肝实质细胞脂肪变性和脂肪储积为特征的病理综合征[1]，疾病谱包括非酒精性肝脂肪变、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化和肝细胞癌(HCC)[2]。肝细胞内脂质特别是甘油三酯(TG)沉积是形成NASH的前提[3]。化痰祛湿活血方是全国第五批名老中医指导老师赵文霞教授治疗NASH的经验方，临床应用26年，效果显著[4-5]。前期体内、外实验均显示化痰祛湿活血方可通过升高脂联素(adiponectin, ADPN)及AdipoR2 mRNA水平，减少肝细胞内脂肪蓄积，减轻肝脏炎性，表明化痰祛湿活血方在降脂保肝、改善脂质蓄积等方面的疗效与其激活ADPN相关[6]，但具体机制尚不明确。本研究观察化痰祛湿活血方对ADPN相关信号通路PI3K/Akt/NF-κB蛋白的影响，探讨此信号通路与NASH相关炎症发生发展的关系，进而探究其防治NASH的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SD雄性大鼠72只，SPF级，体质量(150±10)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。动物合格证号：11400700116588；许可证号：SXYK(豫)2015-0005。本研究方案经由河南中医药大学审批(批号：DWLL15010018)，符合实验室动物管理与使用准则。

1.1.2 药物 化痰祛湿活血方颗粒剂：泽泻，批号：15120135；丹参，批号：15060138；海藻，批号：15070027；郁金，批号：15060128；决明子，批号：15090036；山楂，批号：15060020；柴胡，批号：15070208；水飞蓟，批号：15070223；由四川新绿色药业科技发展股份有限公司提供。多烯磷脂酰胆碱胶囊：赛诺菲(北京)制药有限公司，批号：5JD070。高脂饲料：普通饲料(84%)、猪油(10%)、蛋黄粉(5%)、胆固醇(1%)。饲料由河南省实验动物中心加工而成。

1.1.3 试剂 Anti-Adiponectin抗体(CST公司，货号：2789S)；Anti-ADIPOR2抗体(ProteinTech公司，货号：14361-1-AP)；Anti-PI3Kinase p85抗体(ABCAM公司，货号：ab180967)；Anti-AKT1/2抗体(ABCAM公司，货号：ab188099)；Anti-AKT1 (phospho T308)抗体(ABCAM公司，货号：ab66134)；Anti-NF-κB p65抗体(ABCAM公司，货号：ab16502)；Anti-NF-κB p65 (phospho S536)抗体(ABCAM公司，货号：ab86299)；β-Actin 抗体(ProteinTech公司，货号：20536-1-AP)；GAPDH抗体(ProteinTech公司，货号：10494-1-AP)；BCA蛋白定量分析试剂盒(Thermo Fisher公司，货号：23227)。

1.1.4 仪器与设备 BS-0220生化分析仪(深圳迈瑞)，电泳仪(BIO-RAD，美国)，凝胶成像分析系统(BIO-RAD，美国)。

1.2 方法

1.2.1 NASH大鼠模型制备 参考文献[7]并结合前期实验结果，选定制备NASH大鼠模型制备方法：高脂饲料，喂养9周。

1.2.2 动物分组与用药 适应性喂养1周后，将大鼠按体质量分层随机分为空白组、模型组、多烯组、高剂量组、中剂量组、低剂量组，共6组，每组12只。空白组给予普通饲料，其余各组给予高脂饲料，喂养9周。同时模型组给予生理盐水1 ml·100 g-1·d-1灌胃，其余治疗组分别给予多烯磷脂酰胆碱胶囊混悬液0.028 5 g·100 g-1·d-1(相当于成人剂量的10倍)灌胃，化痰祛湿活血方5.04 g·100 g-1·d-1(相当于成人剂量的20倍)灌胃，化痰祛湿活血方2.52 g·100 g-1·d-1(相当于成人剂量的10倍)灌胃，化痰祛湿活血方1.26 g·100 g-1·d-1(相当于成人剂量的5倍)灌胃。模型组大鼠因相互撕咬死亡1只，化痰祛湿活血方高、中、低剂量组大鼠分别因灌胃不当死亡1只，中剂量组大鼠相互撕咬死亡1只，多烯组灌胃不当死亡1只。第10周实验结束后，处死大鼠，采集大鼠血液、肝组织。血液离心后留取上清，立即行生化学检测。新鲜肝组织低温转送本院病理科行冰冻切片，备做油红O染色，剩余肝组织用锡纸包裹，液氮快速冷冻后，放至-80 ℃冰箱，备做蛋白检测。

1.2.3 肝组织油红O染色 新鲜肝组织用OTC包埋剂包埋，甲醛钙固定，60%异丙醇清洗，油红次液(油红原液与双蒸水比例为3∶2，定性滤纸过滤掉沉渣，现配现用)染色，60%异丙醇洗浮色，蒸馏水洗，苏木精染核，蒸馏水洗，晾干，封片，观察，摄片。

1.2.4 血清生化指标变化 采用迈瑞BS-220全自动生化分析仪检测血清中ALT、AST、ALP、GGT、TC、TG水平。

1.2.5 肝组织蛋白检测(Western-Blot法) BCA法测定蛋白含量。取蛋白30 μg经过电泳、转膜，而后用封闭液室温摇床封闭1 h，经过3次洗膜，用一抗室温摇床孵育10 min，4 ℃冰箱过夜。分别加入二抗，生化培养箱37 ℃，30 min孵育，再经过3次洗膜，每次5 min。取ECL化学发光，凝胶成像系统成像拍照分析。同时以β-actin/GAPDH作为内参，检测ADPN、AdipoR2、PI3K、Akt、pAkt、NF-κB、p-NF-κB蛋白的表达情况。

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织油红O染色 空白组肝细胞胞浆、胞核呈蓝色，未见明显橘红色脂滴。模型组肝细胞胞浆中可见多个大小不等的橘红色脂滴，呈弥漫性分布，验证造模成功。各用药组肝细胞脂滴缩小并减少，染色变浅，其中中药高剂量组仅有少量细小红色脂滴呈散在性分布，与空白组最为接近(图1)。

2.2 各组大鼠血清生化指标比较 与空白组相比，模型组大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、TG、TC水平均显著增高(P值均<0.05)；与模型组比较，所有治疗组大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、TG、TC水平均显著降低(P值均<0.05)；与多烯组比较，高剂量组大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、TG、TC水平均显著降低(P值均<0.05)(表1)。

注：a，空白组；b，模型组；c，多烯组；d，高剂量组；e，中剂量组；f，低剂量组。

2.3 各组肝组织ADPN、AdipoR2、PI3K蛋白表达情况 与空白组比较，模型组大鼠肝组织中ADPN、AdipoR2、PI3K蛋白表达均明显降低(P值均<0.05)；与模型组比较，各治疗组ADPN、AdipoR2蛋白表达均明显升高(P值均<0.05)，高、中、低剂量组PI3K蛋白表达亦明显升高(P值均<0.05)；与多烯组比较，高剂量组ADPN、AdipoR2、PI3K蛋白表达均显著增加(P值均<0.05)(图2，表2)。

图2 各组大鼠肝组织ADPN、AdipoR2、PI3K蛋白表达电泳图

表1 各组大鼠血清生化指标比较

注：与空白组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05；与多烯组比较，3)P<0.05。

2.4 各组肝组织Akt、p-Akt、NF-κB、p-NF-κB蛋白表达情况 与空白组比较，模型组大鼠肝组织Akt、p-Akt蛋白表达均明显降低(P值均<0.05)，NF-κB、p-NF-κB蛋白表达均明显升高(P值均<0.05)；与模型组比较，各治疗组大鼠肝组织p-Akt蛋白表达均明显升高(P值均<0.05)，NF-κB、p-NF-κB蛋白表达均明显降低(P值均<0.05)；与多烯组比较，高剂量组p-Akt蛋白表达明显升高，NF-κB、p-NF-κB蛋白表达均明显降低(P值均<0.05)(图3，表3)。

图3 各组大鼠肝组织Akt、p-Akt、NF-κB、p-NF-κB蛋白表达电泳图

3 讨论

“二次打击”学说是目前公认的NASH发病机制，脂质过氧化损伤，微粒体、线粒体功能受抑制，肝细胞凋亡、星状细胞激活，诱发NASH和肝纤维化[8-9]。

研究[10-11]发现，ADPN能够改善胰岛素抵抗，增加脂肪氧化分解血清游离脂肪酸(free fatty acids，FFA)，降低FFA水平、抑制炎症因子的产生，进而阻断NASH的形成与进展。但ADPN与其受体结合才能发挥其生物学作用，其受体主要有 AdipoR1和AdipoR2两种，AdipoR2主要存在于肝脏[12]。ADPN与其受体结合后，发挥多种生物学作用，如抗肥胖、抗炎、抗动脉粥样硬化等，减少体脂肪，改善胰岛素抵抗[13]。其下游 PI3K-Akt 信号通路通过对下游分子的活性调节调控糖异生及脂肪酸合成，而传导通路的阻滞是外周组织胰岛素抵抗发生的基本机制之一。特异性激活PI3K-Akt 信号通路是包括糖尿病等胰岛素抵抗相关的多种疾病的潜在干预靶点[14]。磷酸化激活的Akt，可进一步磷酸化NF-κB、Caspase-9、GSK- 3、FoxOs及mTOR等蛋白，介导胰岛素抵抗及细胞增殖、周期调节等[15]。NF-κB 调节多种靶基因的表达，可高效诱导多种细胞因子(如IL-6、TGFβ1、TNFα)、趋化因子(如IL-8、补体C3)、急性期反应蛋白(如C反应蛋白、β-微球蛋白)、黏附分子、免疫识别受体的表达。同时对参与炎症反应放大与延续的相关酶(一氧化氮合酶、环氧化酶-2等)的基因表达有重要的调控作用[16]。

NASH主要因饮食不节、过度肥胖、久坐少动、精神紧张等病因导致肝疏泄失职，脾运化失权，水湿内停，痰浊内生，气滞血瘀[17]。脾虚失运是导致NASH的起始原因，随着病程进展，土虚木乘，肝脾失调，痰湿内生，恶性循环[18]。总病机为痰湿蕴结、气血阻滞，久则闭阻肝络诱发本病。本研究以化痰祛湿活血为治则，方中以泽泻利水渗湿、行气消瘀为君药，丹参活血化瘀、凉血安神，郁金活血止痛、行气解郁，海藻化痰利湿、软坚消痰，共为臣药，决明子清肝明目，山楂消积散瘀，水飞蓟清热解毒，共为佐药，柴胡疏肝理气，引药入肝经为使药。全方共奏化痰祛湿活血之功效。经临床及实验研究证实其有良好治疗NASH作用。

表2 各组大鼠肝组织蛋白ADPN、AdipoR2、PI3K相对表达水平比较

注：与空白组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05；与多烯组比较，3)P<0.05。

表3 各组大鼠肝组织蛋白Akt、p-Akt、NF-κB、p-NF-κB相对表达水平比较

注：与空白组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05；与多烯组比较，3)P<0.05。

本实验结果显示，NASH大鼠肝组织AdipoR2、PI3K、pAkt蛋白表达降低，炎症激活因子NF-κB、p-NF-κB蛋白表达升高，化痰祛湿活血方可能通过上调ADPN，上调PI3K、Akt，进而抑制NF-κB的转录激活而达到治疗NASH的作用，有效改善血清肝功能及血脂水平。且化痰祛湿活血方高剂量组优于中、低剂量组，说明化痰祛湿活血方可能存在剂量依赖效应。目前尚无NASH特异性治疗药物，该研究有助于中药在NASH中的扩大应用，为临床治疗NASH提供理论依据。