血清寡糖链检测对HBV相关肝细胞癌的诊断价值

张立丽， 金子铮， 刘 宁， 赵艳明， 佟 瑄， 赵 艳， 娄金丽

首都医科大学附属北京佑安医院 临检中心，北京 100069

人体血液中的糖蛋白主要是由肝脏合成，其合成代谢与肝脏的功能密切相关。在健康状态下血液中的糖蛋白上连接的寡糖结构是相当稳定的，各寡糖的相对含量也是基本固定的，在肝癌发生时，肝脏的糖蛋白合成代谢将会有所改变，表现在寡糖结构和含量上的变化。寡糖链检测(G-Test)试剂盒通过检测血清中寡糖链的含量, 计算分析出寡糖链组分的相对含量(G值)与肝细胞癌(HCC)的相关性。本研究对该试剂辅助诊断HBV相关HCC的临床性能进行评估。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2017年8月-2018年6月就诊于本院的310例患者的血清样本资料。根据病因分为HBV相关HCC组(HCC组)、乙型肝炎肝硬化组(肝硬化组)、慢性乙型肝炎组(肝炎组)和其他恶性肿瘤组。

诊断标准：慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化根据《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[1]进行诊断，其他脏器恶性肿瘤诊断标准根据各肿瘤临床诊断指南或标准。HBV相关HCC纳入标准为HBsAg必须是阳性，同时符合下列任何一项即可：(1)病理诊断为HCC，诊断依据符合《原发性肝癌诊疗规范(2011年版)》[2]；(2)临床诊断为HCC(除病理诊断之外的其他临床诊断方法可以明确诊断为HCC)。排除标准：丙型肝炎患者血清样本。本研究经首都医科大学附属北京佑安医院伦理委员会审批(批号：京佑伦字[2017]0187号)，患者均签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器 G-Test试剂盒(荧光毛细管电泳法，江苏先思达生物科技有限公司)，AFP检测试剂盒(电化学发光法，德国罗氏诊断产品有限公司)。ABI3500Dx基因测序仪(美国Life Technologies公司)，Roche Cobas e601电化学发光分析仪(德国罗氏公司)。

1.3 寡糖链检验(G-Test) ABI3500Dx测序仪进行毛细管微电泳分离、测量样本中寡糖链的含量即指纹图谱(简称G-Test 图谱)，通过计算分析寡糖链组分的相对含量关系(G值)与HCC的相关性：(1)G值≥5时，判定结果为阳性;(2)G值<5时，判定结果为阴性。

1.4 血清AFP检测 按照Roche Cobas e601电化学发光分析仪及配套试剂盒说明书操作检测各研究对象血清AFP的表达水平，参考范围为 <7 ng/ml。

1.5 统计学方法 采用SPSS24.0软件进行统计分析，非正态计量资料以M(P25～P75)表示，多组间比较采用Kruskal-WallisH检验，进一步两两比较使用Dunn’s多重比较；计数资料两组间比较采用χ2检验。试剂的灵敏度、特异度、总符合率采用SAS9.4软件进行统计分析, 使用Medcalc 19.0进行受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析，ROC曲线下面积(AUC)的比较采用Z检验。利用logistic回归建立G-Test与AFP联合诊断模型, 使用Graphpad绘制点图。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 310例患者中HCC组170例、肝硬化组50例、肝炎组85例、其他恶性肿瘤组5例(结肠癌1例，胆管恶性肿瘤1例，十二指肠癌1例，喉高分化鳞1例，左肺腺癌1例)。男230例，女80例，年龄22～81岁。HCC组患者G值[6.46(5.73～7.07)]明显高于肝炎组[3.38(2.85～4.18)]及肝硬化组[3.99(3.13～5.21)](H值分别为107.9、104.2，P值均<0.001)；HCC组患者AFP水平明显高于肝炎组[0.77(0.45～1.77)log10ng/ml vs 0.58(0.41～0.89)log10ng/ml，H=33.65，P=0.025](图1)。其他恶性肿瘤组患者只有3例，未进行比较。

图1 各组间G-Test和AFP水平的比较

2.2 G-Test和AFP诊断HCC的各项指标

2.2.1 G-Test诊断HCC 将HCC组患者设为阳性组(n=170)，G-Test阳性142例，阳性符合率即灵敏度为83.53%；肝硬化组、肝炎组和其他恶性肿瘤组3组设为阴性组(n=140)，G-Test阳性36例，阴性104例，阴性符合率即特异度为74.29%。总体符合率为79.36%，阳性预测值79.78%，阴性预测值78.79%。

2.2.2 G-Test、不同临界值AFP及其二者联合诊断HCC各项指标的比较 310例患者中300例具有AFP检测结果，其中HCC 167例，非HCC 133例。血清AFP水平的临界值分别选取>20、>200、>400 ng/ml。G-Test的灵敏度远高于不同临界值的AFP，但特异度略低于AFP(表1)。

G-Test的AUC明显高于AFP(0.846 vs 0.611，Z=5.795，P<0.001)(图2)。使用logistic回归建立G-Test与AFP联合诊断模型：联合诊断模型得分=-4.33+0.879×G+0.001×AFP。联合诊断模型诊断HCC的AUC为0.870，高于G-Test(Z=2.523，P=0.012)和AFP(Z=6.943，P<0.001)(图3)。联合诊断模型得分的最佳cut-off值为4.53，对应的灵敏度为85.03%，特异度为86.47%，约登指数为0.715，明显优于G-Test和AFP的单独诊断效能。

表1 G-Test与AFP诊断HCC性能指标的比较

图2G-test及AFP单项诊断HCC的ROC曲线

图3 G-Test联合AFP诊断模型诊断HCC的ROC曲线

2.2.3 不同分期HCC患者的G-test和AFP检出率比较 按照《原发性肝癌诊疗规范(2017版)》[3]对HCC患者进行分期，69例可明确分为早期组(Ⅰa期和Ⅰb期，n=26)和中晚期组(n=43)。不管是早期还是中晚期HCC患者，G-Test检出率均高于AFP检出率(P值均<0.001)(表2)。

表2 不同分期HCC患者的G-test和AFP检出率比较[例(%)]

2.2.4 AFP阴性HCC患者中G-Test的检出率 AFP分别以<20、<200、<400 ng/ml为阴性临界值分为3组，3组的HCC患者分别为109、135和143例。3组的G-Test(G值≥5)检出率分别为86.24%(94/109)、85.93%(116/135)、85.31%(122/143)。

3 讨论

HCC是目前我国第四位常见恶性肿瘤及第三位肿瘤致死病因[3]。HCC的诊断主要通过B超、CT、MRI[4]等影像学方法，各种方法各有其特点，需相互补充，全面评判；肝穿刺因其为有创操作，存在出血及针道种植的风险，有时难以被患者所接受。AFP是唯一被广泛用于HCC诊断和复诊的血清标志物[5-6]。国外通过对肝硬化患者AFP阈值水平(20 ng /ml)的系统综述评估，发现在任何HCC阶段其敏感度为41%～65%，特异度为41%～94%[7]。一项多中心病例对照研究[8]显示在早期HCC(BCLC阶段0和A)cut-off值较低时(10.9 ng/ml)，AFP的敏感度和特异度分别高达66%和82%，但并不能满足临床需求。为了改善HCC诊断的准确性，需要额外的生物标志物来辅助AFP。

N-糖组是一种新的有效肝脏疾病血清标志物[9]。大多数的血清N-糖蛋白是由肝脏和B淋巴细胞合成的，血清中总N-聚糖的变化可能反映了肝脏或B淋巴细胞的生理改变。G-Test测量的寡糖链即N-聚糖，该检测方法是将传统生化特异反应与高灵敏度的荧光标记相结合，同时引用毛细管电泳高分离技术，实现了在普通生化检验实验室即可以操作的，微量简便高通量的血液糖蛋白寡糖链指纹图谱分析[9-11]。

本研究中G-Test灵敏度为83.53%，特异度为74.29%，总体符合率为79.36%，阳性预测值79.78%，阴性预测值78.79%，诊断性能较好。在300例样本中，G-Test 的灵敏度(83.83%)远高于不同临界值的AFP(34.73%、19.16%、14.37%)，但特异度(74.44%)略低于AFP(83.46%，96.99%，97.74%)。ROC曲线分析表明，G-Test的AUC明显高于AFP(Z=5.795，P<0.001)，G-test诊断HCC的效能优于AFP。G-Test联合AFP诊断模型的最佳cut off值为4.53，对应的灵敏度为85.03%，特异度为86.47%，约登指数为0.715，明显优于G-Test和AFP单项诊断效能。由此说明，G-Test与AFP联合检测可使G-Test的高灵敏度与AFP的高特异度实现优势互补，增加了灵敏度与特异度，为临床辅助诊断HCC提供一个新的检测策略。

在慢性肝病进展至HCC的过程中，患者血清中N-糖蛋白糖基化修饰均会发生异常变化, 不同的肿瘤中也会有N-聚糖的改变[12-14]，可能降低了G-Test在HCC中的诊断特异度。另有研究[9]显示在cut-off值为0.34的情况下，应用两个N-聚糖峰值的比值(命名为GlycoHCCTest)检测HCC的特异度和敏感度与AFP阈值为100 ng/ml时非常相似，也有学者[15]认为在病因确定(如HBV或HCV感染)的前提下，应用血清N-聚糖标志物诊断肝纤维化/肝硬化和HCC效果较好。

Liu等[9]报道血清N-聚糖的分析是一种新颖的区分肝硬化和HCC患者的筛查方法，GlycoHCCTest区分HCC和肝硬化患者的准确性达81%±3%。血清AFP在肝硬化患者中检测HCC的作用是非常有限的[16]。国内亦有报道[17]血清AFP对肝炎、肝硬化的鉴别诊断价值较低。本研究中，HCC患者G-Test的水平明显高于肝炎及肝硬化患者(P<0.001)，表明G-Test能较好地区分HCC与肝炎，肝硬化；HCC患者AFP的水平明显高于肝炎患者(P<0.05)，但HCC患者与肝硬化患者差异无统计学意义，是否提示G-Test对于HCC与肝硬化的鉴别诊断性能优于AFP，将通过扩大临床样本量进一步研究证实。

本研究进一步比较了G-test和AFP在不同分期HCC中的检出率，早期和中晚期HCC的G-test(G值≥5)检出率均高于AFP>400 ng/ml的检出率， AFP阴性的HCC患者中G-Test的检出率分别为86.24%、85.93%、85.31%，综上进一步说明G-test对早期HCC的诊断更灵敏，可以作为一个新的HCC早筛、早诊的辅助指标，同时可以弥补AFP灵敏度低的不足，减少HCC的漏诊率。

本研究仅评价了血清N-聚糖对HBV相关HCC的诊断性能，对于其他病因导致的慢性肝病，如酒精性肝纤维化/肝硬化等，血清N-聚糖将发生何种改变，还需要进一步研究。那么，G-test是否可通过进一步各种病因及干扰因素的大量临床实验研究，重新界定G-Test的阈值，以提高其特异性，是笔者进一步研究的方向。