不同发酵条件对氨化玉米秸秆粗蛋白质含量的影响

2020-04-24谢小来魏川子马逢春陈明明孙悠然焦培鑫

东北农业大学学报 2020年2期

谢小来，魏川子，马逢春，陈明明，王雪，孙悠然，焦培鑫

（东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030）

我国玉米秸秆资源丰富，但秸秆利用率较低，处理不当易造成环境污染。玉米秸秆作为牛羊等反刍动物普遍应用的粗饲料，可提供大量粗饲料来源，但营养价值低、适口性差且消化率低。因此，探索安全、实用的玉米秸秆饲料加工调制技术，对我国环境保护和畜牧业可持续发展具有重要意义。

斯日古楞等将玉米秸秆中添加尿素，袋贮试验表明，随尿素（1%、2%、3%、4%）添加量增加玉米秸秆粗蛋白质含量逐渐提高，添加尿素4%使玉米秸秆粗蛋白质含量提高到8.71%[1]。但采用尿素氨化玉米秸秆，氨挥发损失较多，污染环境。王雨琼等选取侧耳属白腐菌，从营养价值和抗氧化性能角度研究白腐菌对玉米秸秆的影响，发现发酵物中干物质体外消化率、粗蛋白质含量、抗氧化性能显著提高（P＜0.05）[2]。杨娟等利用解淀粉芽胞杆菌作发酵试验发现，该菌株可提高秸秆饲料利用率[3]。生物法处理可提高玉米秸秆粗蛋白质含量，改变营养组成，但耗费时间长、发酵效率低、碳水化合物损失大。杨雪霞等对玉米秸秆作氨化汽爆处理，高温下短时间氨化秸秆（8 min）与常温氨化（30 d）相比，缩短氨化时间，氨化后秸秆中氮含量提高，处理后秸秆富集大量可发酵性碳源、氮源，将氨化汽爆后玉米秸秆固态发酵，粗蛋白质含量显著提高，比直接发酵玉米秸秆粗蛋白质含量提高1 倍[4]。氨化可增加秸秆中氮元素，为酵母菌生长提供氮源。酵母菌发酵时将无机氮转化为蛋白质，酵母菌生长过程出现的各种酶和其他营养成分，可有效提高玉米秸秆消化率和营养价值[5]。通过酵母菌产出的单细胞蛋白质品质良好，营养丰富，尤其是选用产朊假丝酵母，获得菌株的蛋白质含量更高，可生产动物饲料[6]。本试验采用东北农业大学自主研发的高压密闭秸秆氨化系统处理玉米秸秆，制成进一步发酵试验的氨化玉米秸秆原料。选择产朊假丝酵母为发酵处理菌种，对氨化后玉米秸秆作微生物处理，探究氨化玉米秸秆粗蛋白质含量最适发酵条件，为提高玉米秸秆营养价值提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料

原料：玉米秸秆（由东北农业大学反刍动物营养实验室提供）。

1.1.2 菌种

产朊假丝酵母（购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号2.1180）。

1.1.3 培养基

产朊假丝酵母培养基：酵母膏0.3%，麦芽浸膏0.3%，蛋白陈0.5%，葡萄糖1%。

1.1.4 试验仪器

超净无菌操作台、隔水式恒温培养箱、IS-RDV1 气浴恒温振荡器、高压灭菌锅、冰箱、DZ-400/2S型真空包装机、FOSS凯氏定氮仪。

1.2 玉米秸秆氨化处理

玉米秸秆经自然风干，粉碎过20 目筛后经室温密封保存。采用高压密闭秸秆氨化系统，设置压强0.3 MPa，对玉米秸秆作2 h氨化处理。

1.3 菌种活化

用1%葡萄糖、0.3%麦芽浸膏、0.3%酵母膏配制液体活化培养基，装入锥形瓶高压灭菌（121 ℃，15 min），灭菌后将液体培养基放入超净无菌操作台冷却至室温。将原种（斜面培养基保存的酵母菌）接种于液体培养基，气浴恒温振荡器中培养48 h（28 ℃，150 r·min-1），为一级菌液；继续采用液体活化培养基高压灭菌冷却至室温，接种一级菌液，气浴恒温振荡器中培养24 h（28 ℃，150 r·min-1），为二级菌液，制得酵母液体菌种为4.7×107cfu·mL-1，甘油封存备用。

1.4 氨化玉米秸秆发酵试验

1.4.1 氨化玉米秸秆发酵处理

将57 个15.5 cm×24 cm 发酵袋中分别装入100 g 氨化玉米秸秆，用灭菌小喷瓶分别加入所需要酵母菌液和相应水分含量，混匀后真空密封，分别放入相应温度隔水式恒温培养箱，发酵对应天数后取出，烘箱65 ℃烘48 h，回潮24 h，保存待测。

1.4.2 单因素试验设计

采用4 个单因素（发酵温度、发酵时间、含水量、酵母菌接种量）多水平试验设计，研究某一因素对氨化玉米秸秆粗蛋白质含量的影响时，其他因素（参考条件：28 ℃、48 h、65%含水量、5%接种量）保持一致。温度：24、28、32、36 ℃。时间：24、48、72、96、120 h。含水量：55%， 60%,65%, 70%, 75 %。接种量（%，V/W，V：菌液体积；W：氨化玉米秸秆重量）：1%,3%，5%，7%，9%。对照组为未发酵氨化玉米秸秆。

1.4.3 响应面优化设计

根据Box-Behnken组合试验设计原理，通过温度A、时间B、含水量C和酵母菌接种量D作四因素三水平响应面分析试验。响应面试验因素水平见表1。

表1 响应面试验因素水平和编码Table 1 Response surface test factor levels and coding

1.5 测定指标及方法

粗蛋白质（CP）测定，凯氏定氮法[7]。

1.6 数据处理与分析

试验数据输入Excel 并利用SPSS 22 软件作One-Way ANOVA 方差分析和Duncan's 多重比较，数据用平均值±标准差表示，以P＜0.05表示差异显著。采用Design-Expert 软件作响应面试验设计和数据分析。

2 结果与分析

2.1 发酵温度、时间、含水量、酵母菌接种量对氨化玉米秸秆粗蛋白质含量的影响

2.1.1 发酵温度

由表2得出，发酵产物中粗蛋白质含量随着温度升高呈先升后降趋势。不同温度处理组与对照组（编号5）之间差异均显著（P＜0.05）。24 ℃组粗蛋白质含量分别与28 ℃、32 ℃、36 ℃粗蛋白质含量差异显著（P＜0.05）。28 ℃与36 ℃组粗蛋白质含量差异不显著（P＞0.05）。32 ℃组粗蛋白质含量最高为16.17%，且32 ℃组粗蛋白质含量分别与24 ℃、28 ℃、36 ℃粗蛋白质含量差异显著（P＜0.05）。因此选择32 ℃为较适宜温度参数。

2.1.2 发酵时间

由表2得出，发酵产物中粗蛋白质含量随着时间增加呈先升后降趋势，48 h 组粗蛋白质含量最高为15.64%，72 h 略降低。处理组粗蛋白质含量均高于对照组（编号11）（P＜0.05）。24 h组粗蛋白质含量差异显著（P＜0.05）。48 h与96 h组粗蛋白质含量差异显著（P＜0.05），且与120 h 组粗蛋白质含量差异显著（P＜0.05），但48 h与72 h组差异不显著（P＞0.05）。而72 h 组粗蛋白质含量分别与24 h、96 h、120 h 组粗蛋白质含量差异不显著（P＞0.05）。因此选择48 h 为发酵氨化玉米秸秆适宜时间参数。

表2 发酵温度、时间、含水量、酵母菌接种量对氨化玉米秸秆粗蛋白质含量的影响（干物质基础）Table 2 Effect of fermentation temperature,time,water content,and yeast inoculum on crude protein content of ammoniated corn stalks(DM basis)

2.1.3 发酵含水量

由表2得出，发酵产物中粗蛋白质含量随着水分含量增加呈先升后降趋势，65%组粗蛋白质含量达到最高为15.89%。不同含水量处理组与对照组（编号17）之间差异均显著（P＜0.05）。60%与75%组粗蛋白质含量差异显著（P＜0.05）。65%组粗蛋白质含量显著高于55%组、60%组、70%组、75%组（P＜0.05）。因此选择含水量65%为发酵适宜参数。

2.1.4 酵母菌接种量

由表2得出，随着酵母菌接种量增加发酵产物中粗蛋白质含量逐渐增加，接种量为9%时略降低。不同酵母菌含量处理组与对照组（编号23）之间均差异均显著（P＜0.05）。1%组分别与3%、5%、9%粗蛋白质含量差异均显著（P＜0.05）。9%组分别与3%、5%粗蛋白质含量差异显著（P＜0.05）。7%组分别与1%、3%、5%、9%组粗蛋白质含量差异显著（P＜0.05），且接种量为7%时，粗蛋白质含量最大为16.72%。因此选择酵母菌接种量为7%为适宜参数。

2.2 响应面分析与方差分析

通过单因素试验，得出发酵温度28～36 ℃，发酵时间24～72 h，发酵时含水量60%～70%，发酵时酵母菌接种量5%～9%时，粗蛋白质含量较高。为进一步优化酵母菌发酵氨化玉米秸秆工艺参数，以温度、时间、含水量和酵母菌接种量为自变因素，以粗蛋白质含量为响应值，采用Design-Expert软件设计一组四因素三水平含29个处理组的响应面试验，响应值见表3。

由表3 得出，第17 个处理组粗蛋白质含量最高，即在发酵温度32 ℃，发酵时间48 h，发酵时含水量65%，酵母菌接种量7%条件下，发酵后氨化玉米秸秆粗蛋白质含量最高为17.01%。利用Design-Expert 软件分析试验数据，得到二次多项回归方程：

其中，R 为粗蛋白质含量，A、B、C 和D 分别对应温度、时间、含水量和酵母菌接种量编码。

表3 发酵氨化玉米秸秆中粗蛋白质含量响应面试验结果Table 3 Response surface test results of crude protein content in fermented ammoniated corn stalks

方差分析结果及显著性分析见表4，失拟项P=0.6833＞0.05，说明回归方程拟合度较好。模型F=83.49，P＜0.0001差异极显著，说明该模型显著。模型R2=0.9882，拟合程度较高，可分析和预测最优发酵工艺参数。

由表4可知，温度、时间、含水量和酵母菌接种量对粗蛋白质含量影响均显著（P＜0.05）。对于交互作用而言，AB、AD、BD、CD是显著项。

表4 回归方程方差分析Table 4 Regression equation analysis of variance

3 讨论

3.1 发酵温度、时间、含水量、酵母菌接种量对氨化玉米秸秆粗蛋白质含量的影响

3.1.1 温度因素

温度过低抑制酵母菌生长和繁殖，从而影响发酵原料粗蛋白质含量，因此适当的温度范围内，提高温度可增强酵母菌活性，利于发酵[8]。温度过高，则抑制酵母菌活性，影响发酵原料粗蛋白质终含量。邓怡国等研究指出菠萝叶渣厌氧发酵产气量在温度25～35 ℃呈逐渐增加趋势，35 ℃时产气量最大，35 ℃上升至40 ℃时，产气量随温度升高而下降[9]。尚红岩研究结果表明酵母菌最高活性发酵温度为30～32 ℃[10]。梁裕崴的A21酵母菌性能测试结果表明，该酵母在25～35 ℃时正常生长，最适发酵温度为28～31 ℃[11]。发酵效果随温度升高呈先升后降趋势，最适温度时发酵效果最佳，与本试验研究一致。兰晓勇等利用冠突散囊菌固态发酵苦荞，苦荞总蛋白含量先降后升，24 ℃时达到最高[12]；球蛋白含量先增后降，28 ℃时球蛋白含量最高；醇蛋白含量先增后降，发酵温度为30 ℃时，醇蛋白含量最高；清蛋白先降后增，32 ℃时最高；谷蛋白在发酵温度24～32 ℃范围内，含量无明显变化。发酵时不同蛋白质含量随温度变化趋势不同，不同蛋白质含量最高发酵温度不同。本文仅探讨温度对玉米秸秆粗蛋白质含量的影响，应进一步研究温度对玉米秸秆中其他蛋白质成分的影响。

3.1.2 时间因素

酵母菌发酵产物和含量随酵母菌生长阶段而改变。一般情况下，发酵初期，随发酵时间推移，酵母菌大量繁殖，粗蛋白质含量显著增加[13]。到达最适发酵时间，产品粗蛋白质含量达到最大值且基本保持恒定。发酵时间过长，酵母菌进入衰退期，逐渐自体溶解，产品粗蛋白质含量逐渐降低[14]。单立莉等研究不同发酵时间对发酵产品品质的影响，48 h 时发酵产品粗蛋白质含量最高[15]，与本试验研究结果一致。刘纪成等[16]采用多菌混合发酵方法处理花生秸秆，发酵时间分别为（3、5、10、15 d），以粗蛋白质和纤维素酶活为考查指标，结果发现10 d 的发酵效果较好，粗蛋白质含量为15.37%。这与本试验结果不一致，因其采用多菌混合发酵方法，时间设置不同，因此发酵时间存在差异。本试验考虑利用最少时间达到最优处理效果，减少时间成本。提高氨化玉米秸秆粗蛋白质含量，选用多菌种代替单一产朊假丝酵母对其发酵处理有待研究。氨化玉米秸秆粗蛋白质含量提高程度和发酵菌种有关。

3.1.3 含水量因素

对固态发酵来说，水分含量是影响菌体蛋白增加的重要因素[17]。含水量过低时，不利于酵母菌细胞扩散，抑制其生长；含水量过高，原料黏性增加，散热差，不利于酵母菌生长[18]。当含水量适宜时，原料颗粒之间疏松度适宜有利于排出微生物代谢产生CO2，促进微生物菌体生长，且发酵料中氨态氮和蛋白质产物在水中有一定溶解性，降低粗蛋白质损失。刘强等试验中设置不同梯度含水量（15%、20%、25%、30%、35%、40%、45% 和50%），发现发酵菜籽粕粗蛋白质含量随水分梯度先升后降，40%时粗蛋白质含量最高[19]。本试验发现含水量为65%时发酵效果最好，可能因发酵原料差异和发酵过程所用菌株不同。刘晓明等以酵母菌、乳酸菌等分别固态发酵豆粕、玉米和棉籽粕，设置4个梯度含水量，结果表明不同菌株对不同发酵原料所需最适水分含量均不同[20]。惠文森等采用安琪酵母菌发酵玉米秸秆，研究发现含水量对发酵效果有显著影响，含水量低，发酵效果差，营养物质含量变化小，含水量60%～70%时，酵母菌大量繁殖，粗蛋白质含量较高，与未发酵玉米秸秆差异显著[21]。本试验含水量65%时粗蛋白含量最高，与惠文森等研究结果一致，说明产阮假丝酵母发酵时最适含水量为65%。

3.1.4 酵母菌接种量因素

酵母菌接种量小，发酵周期延长，无法充分利用发酵饲料营养物质。随接种量增加，粗蛋白质含量提高[22]。接种量过大时，酵母菌生长旺盛，酵母细胞数量较多，发酵速度过快，易造成温度过高，不利于酵母繁殖，酵母菌自体溶解，粗蛋白质含量略下降。Gibbons 等研究酿酒酵母接种量对饲料固相发酵的影响，接种量为5%时酵母菌生长繁殖较快且乙醇产量最多，接种量更高时反而无优势，低于5%时发酵时间延长且酵母菌数量较低[23]。祁宏山等研究混菌发酵玉米秸秆，8%为最佳接种量，发酵产物中粗蛋白含量最高[24]。孙先锋等将猕猴桃破碎打浆，分别添加不同酵母菌含量（3%、5%、8%），均发酵3 d，发现添加5%酵母菌含量组酒精产量最高[25]。相同条件下，接种量增加使发酵产物在相同培养时间下菌群数更大，相同时间产酶量增加，但菌体过多会消耗大量蛋白质。本试验发现7%酵母菌接种量为最适接种量，差异原因可能与发酵菌株和发酵底物不同有关。

3.2 发酵对氨化玉米秸秆粗蛋白质含量的影响

采用高压密闭秸秆氨化系统对玉米秸秆氨化后发酵，玉米秸秆氮含量大幅增加，富集大量可发酵碳源和氮源，有利于微生物发酵。微生物将纤维素、半纤维素降解并转化为菌体蛋白。高压条件下秸秆半纤维素发生水解，木质素部分降解，有利于发酵时微生物合成菌体蛋白，提高发酵后产物粗蛋白含量。李日强等对玉米秸秆氨化处理后组合菌发酵，氨化后玉米秸秆粗蛋白质含量为13.19%，发酵后粗蛋白质含量为17.64%[26]，与本试验一致。说明在氨化基础上发酵可显著提高发酵产物粗蛋白质含量。谭礼将已氨化、发酵处理粉状秸秆饲喂健康白鼠，结果发现采食量和体重饲喂氨化发酵秸秆的白鼠均高于对照组白鼠，解剖试验白鼠未发现体表、脏器及呼吸系统出现病理性改变[27]。因此，氨化后发酵玉米秸秆可显著提高粗蛋白质含量，饲喂动物安全可行。