大豆GmFT5a基因启动子受日长调控模式分析

赵 琳，张 妍，刘 颖，许崇晶

（东北农业大学大豆研究所，大豆生物学教育部重点实验室，农业农村部东北大豆生物学与遗传育种重点实验室，哈尔滨 150030）

大豆是典型短日照作物，日照影响大豆开花时间及品质等性状。大豆生长发育过程多数对光周期反应敏感，这一特点严重影响大豆品种跨区种植及适应性。开花是植物由营养生长转向生殖生长的重要过程，由植物内部因素和外部环境共同调控。在各种环境因素中，光周期是决定大豆对日长季节变化适应程度的主要因素之一[1]。

FT 基因是关键开花整合因子，具有高度保守的PEBP结构域，且编码一类磷脂酰乙醇胺结合蛋白[2]。FT 基因最初在拟南芥晚花突变体中被发现，FT 蛋白通过与具有昼夜节律变化的卵磷脂结合促进开花[3]。该基因在不同物种间具有高度保守性，随分子生物学技术发展，越来越多的FT 同源基因从不同植物中分离。目前在水稻中有2个FT同源基因，分别是调控短日照开花的Hd3a和调控长日照开花的RF-T1，当Hd3a和RF-T1 分别在拟南芥和水稻中发生过表达时，均使植物花期提前[4-5]。洋葱中共有6 个FT 同源基因，其中AcFT1 在适宜光周期条件下促进植物组织鳞茎形成，AcFT2 促进开花，而AcFT4 抑制植物组织鳞茎形成[6]。甜菜中包含BvFT1 和BvFT2 两个FT 同源基因，在不发生春化作用条件下BvFT1 抑制BvFT2 表达进而抑制开花，反之则抑制BvFT1表达，提高BvFT2表达促进开花[7]。番茄中分别包含SlSP3D、SlSP5G、SlSP5G1、SlSP5G2、SlSP5G3 和SlSP6A 共6 个FT 同 源 基 因，其中SlSP3D 为番茄开花促进因子，SlSP5G、SlSP5G2及SlSP5G3为番茄开花抑制因子[8]。大豆中有10 个FT 同源基因，分别为GmFT1a、GmFT1b、GmFT2a、GmFT2b、GmFT3a、GmFT3b、GmFT4、GmFT5a、GmFT5b 和GmFT6，其 中GmFT2a 和GmFT5a 为开花促进因子，GmFT1a 和GmFT4 为开花抑制因子[9]。

大豆中不同FT 同源基因功能存在差异，在不同环境条件下，通过相互平衡方式影响开花和成熟时间。在大豆开花调控途径中存在一种“跷跷板”模式的开花调控模型[10]，由于E1基因受日长调节，长日照促进E1基因表达，在长日照条件下E1基因促进开花抑制因子GmFT1a和GmFT4表达，同时E1 基因抑制开花促进因子GmFT5a 和GmFT2a 表达，这时开花促进效应弱于开花抑制效应，大豆表现晚花表型；短日照条件下则相反，短日照抑制E1 基因表达，促进GmFT5a 和GmFT2a 表达进而促进大豆开花[11]。了解基因参与开花途径与调控机理可提高大豆产量提供理论依据，而基因本身启动子区域可能包含一些光周期响应元件、参与昼夜节律元件及一些激素相应元件等，这些元件调控基因表达。基因启动子研究是研究基因功能的一种方式。

目前，FT 基因表达调控方式主要以转录水平为主，启动子是调控转录起始不可缺少的工具之一。启动子是基因5'端一段非编码核苷酸序列，通过自身顺时元件与转录因子相互作用调节基因表达量。启动子区域上不同元件行使不同功能。未经低温处理的植物中，FLC与FT启动子上的CArG box元件相互作用负调控FT表达。苹果中MdF1基因在启动子SUC2 驱动下，使拟南芥花期提前[12]。麻风树中JcFT在35s强启动子作用下使拟南芥提早开花[13]。

李英华等为确定TCT-motif 在调节GmGBP1 表达中的重要性，选择分析长短日照条件下GmGBP1启动子中不同TCT-motif 瞬时表达活性，结果发现短日照条件下诱导GmGBP1 启动子中TCT-motif（SNP-796G）表达，推断GmGBP1 启动子受日长调节，而GmGBP1启动子中TCT-motif（SNP-796G）以日长调节的表达模式发挥光响应元件作用[14]。Liu等分析E1 基因是否影响GmFT1a 表达，通过构建pGreen Ⅱ-0800-GmFT1a pro-LUC 表 达 载 体，初步证明E1 基因存在条件下，GmFT1a 启动子表达活性增强[11]。通过研究基因启动子活性，初步证明启动子表达活性是否受相应条件的影响。

在大豆中，Jiang等通过测序GmFT2a基因启动子区域及其编码区，发现GmFT2a编码区在不同品种间具有高度保守性，GmFT2a启动子区域具有丰富多态性[15]。启动子作为转录水平上重要调控元件，决定基因在特定条件下的表达。关于GmFT2a启动子研究已有报道，另一个大豆开花促进因子即GmFT5a基因启动子研究目前尚未见报道。Cai等发现在调控开花途径中GmFT5a作用与日长有关[16]。因此为进一步确定GmFT5a 基因是否受日长调控，本文采用农杆菌渗透介导的体内瞬时表达方法分析长短日照对GmFT5a基因启动子活性的影响，进一步探讨日长对GmFT5a 基因的影响。推断GmFT5a基因可能通过启动子上光响应元件的调控参与调控光周期。

1 材料与方法

1.1 材料

农杆菌菌株EH105、P19由东北农业大学大豆研究所提供；pGreenⅡ0800载体由山东大学向凤宁教授提供：大肠杆菌Trans1-T1感受态购自TaKaRa公司。Plasmid Mini Kit试剂盒、Gel&PCR Clean Up Kit 试 剂 盒 均 购 自OMEGA 公 司；In-Fusion®HD Cloing Kit 试 剂 盒、PrimeSTAR®Max DNA Polymerase、SmaⅠ限制性内切酶等购自TaKaRa 公司；双萤光素酶报告基因（LUC）检测试剂盒购自Promega公司。PCR引物合成及DNA测序工作均由北京华大基因科技有限公司完成。

1.2 proGmFT5a::LUC融合表达载体构建

根据Phytozome上proGmFT5a序列设计引物（见表1），以东农42 为模板，利用GmFT5a P-F 和GmFT5a P-R 引物作PCR，扩 增proGmFT5a 片 段（1 167 bp），并将扩增产物纯化。提取pGreenII 0800载体质粒，用Sma I 限制性内切酶单酶切，将酶切产物胶回收，通过In-Fusion 无缝连接将pro-GmFT5a片段重组到pGreenII 0800载体上，获得重组质粒。

利用热激法将连接产物转化Trans1-T1 感受态细胞，在含Kan 抗性LB 固体培养基中筛选，挑取单斑，PCR鉴定阳性克隆，测序，将测序正确的结果提取质粒，利用测序正确的proGmFT5a::LUC质粒与pSoup质粒同比例混合，采用电击转化方式共同转化到农杆菌EHA105感受态细胞，在含有抗生素50 mg·L-1Kan，25 mg·L-1Rif 和100 mg·L-1Spec 固体YEP 培养基上筛选，挑取单斑PCR 鉴定。将阳性重组农杆菌与30%甘油以1：1比例混合存放于-80 ℃冰箱，用于注射烟草。

表1 proGmFT5a扩增引物序列Table 1 Primers sequences for GmFT5a promoter amplification

1.3 烟草中瞬时表达分析

按照2：1：1比例将花卉营养土、蛭石、沙土混合均匀，并用水全部浸湿。浸湿后将禾本氏烟草种子用移液枪点播到混合均匀的基质中。选择20 d 左右生长状态良好烟草叶片用于农杆菌侵染。将重组农杆菌和含有P19的农杆菌分别活化一次，并用悬浊液将菌液重悬直至OD600=1，按照1：1 比例将重组农杆菌和含有P19的农杆菌混合均匀，室温静置4 h后注射烟草。对注射菌液的烟草长短日照处理（长日照为16 h光照，8 h黑暗，短日照为16 h黑暗，8 h光照），培养48 h后取样，3次重复。取样材料以海肾萤光素酶为内参，萤火虫萤光素酶测定得到的RLU值除以海肾萤光素酶测定得到的RLU值，根据比值比较经长短日照处理后不同时间点GmFT5a启动子激活程度。

1.4 GmFT5a启动子生物信息学分析

利用PLANTCARE 对GmFT5a启动子序列作顺式元件分析和功能预测。

2 结果与分析

2.1 proGmFT5a::LUC融合表达载体构建

为验证GmFT5a受日长表达影响的情况，本文通过启动子开展研究。首先利用GmFT5a P-F 和GmFT5a P-R引物，以大豆品种东农42为模板扩增出GmFT5a 基因启动子片段，片段长度为1 167 bp（见图1）。然后选择SmaⅠ限制性内切酶单酶切方式将环状pGreenII 0800单酶切切成线性的pGreenII 0800，并用Infusion 连接方式将GmFT5a 基因启动子连接至pGreenII 0800 载体（见图2）。采用热激法将构建的proGmFT5a::LUC载体转化到Trans1-T1感受态细胞中，在含有Kan抗性培养基中筛选，并PCR鉴定获得proGmFT5a::LUC- pGreenII 0800 阳性菌株（见图3）。将测序正确的阳性菌株提取质粒，与pSoup质粒同比例混合，采用电击转化法转化到农杆菌EHA105 感受态细胞中，在含抗生素50 mg·L-1Kan、25 mg·L-1Rif 和100 mg·L-1Spec 固体培养基中筛选，并通过PCR鉴定获得阳性菌株（见图4）。

2.2 proGmFT5a::LUC在烟草中瞬时表达的结果

选择农杆菌介导瞬时表达的方法，将proGmFT5a::LUC菌液注射到本氏烟草中，经长短日照处理48 h后，分别在开灯后4 h和12 h取材。分别分析经长短日照处理后4 h和12 h取材的GmFT5a启动子表达活性。结果如图5、6所示，开灯后4 h与12 h取材结果一致，均为短日照条件下GmFT5a表达活性高于长日照条件下GmFT5a表达活性。可见短日照诱导GmFT5a启动子表达，GmFT5a受短日照诱导，进一步说明GmFT5a为光周期调控因子。

2.3 GmFT5a启动子生物信息学分析

利用在线软件PLANTCARE 分析GmFT5a 启动子序列，分析结果发现GmFT5a 启动子存在5 个与光响应有关顺式元件，分别为BOX 4、G-box、GT1-motif、Gap-box和chs-CMA1a，具体位置及功能如表2 和图7 所示。由此可以推断GmFT5a 参与光周期调控可能通过上述5个与光响应有关的顺式元件实现。

表2 GmFT5a启动子中光响应顺式调控元件位置与推测功能Table 2 Position and speculative function of light-responsive cis-regulatory element in GmFT5a promoter

3 讨论与结论

大豆对光周期响应敏感，其在短日照条件下提早开花，长日照条件下延迟开花。虽然大豆适应性广泛，但其个体品种纬度适应性相对狭窄。适应南方短日照的大豆品种在北方长日照条件下种植，花期往往延迟甚至不开花。适应北方长日照的大豆品种在南方短日照条件下种植，花期提前，产量减少。由此说明，调节开花途径可增加大豆产量。

目前发现调控大豆生育期基因有E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10 和J，其中决定光周期敏感性的基因主要是E1、E3、E4 和E7。E1是大豆特有的调控开花基因，抑制GmFT2a和GmFT5a 表达，且受日长调控，短日照抑制E1表达。E2基因是拟南芥GI同源基因。E2基因主要通过调控GmFT2a 而非GmFT2a 调控开花时间。E3和E4基因是光敏色素光受体，分别为GmPHYA3和GmPHYA2。E3 在红光与远红光量子比较高的长日照条件下调控开花，而E4 是在红光与远红光量子比较低长日照的条件下调控开花。E3和E4基因在光周期调控系统中，GmFT2a 和GmFT5a 在短日照条件下可重复强烈诱导开花，在长日照条件下抑制GmFT5a 和GmFT2a 表达，延长开花时间。综上所述，这些调控结果均表明，大豆光周期调控开花途径在GmFT5a 和GmFT2a 处汇合。因此研究GmFT5a和GmFT2a调控开花途径具有重要意义。

大豆GmFT5a 和GmFT2a 是开花调控过程中的整合因子。Nan 等发现GmFT5a 和GmFT2a 过表达时，大豆Williams 82 在长日照条件下提早开花[17]。Schwartz等发现拟南芥中FT启动子序列发生不同的自然变异，导致开花时间不同[18]。Kong 等发现在拟南芥中，开花相关转录因子调控FT的cis元件表达[9]。不同植物FT基因在拟南芥中异位表达，调控自身开花途径。龙眼FT1a在拟南芥中异位表达时促进植物开花，与其相反的是DIFT2在拟南芥中发生异位表达时则抑制开花[19]。在甘蔗中，ScFT1 在拟南芥中异位表达开花[20]。GmFT2a 和GmFT5a 在拟南芥中异位表达也促进拟南芥提早开花。

Cai等研究证明GmFT5a和GmFT2a共同调节大豆花期，长日照条件下GmFT5a 效应比GmFT2a 更显著，而短日照条件下，GmFT2a 效应比GmFT5a更显著，说明GmFT5a是大豆适应高纬度地区的关键[16]。目前关于GmFT5a 在长短日照条件下诱导大豆开花的个体效应及其对下游开花相关基因的差异调控信息十分有限。因此为确定GmFT5a参与大豆开花途径的调控是否受日长影响，本文通过农杆菌介导的体内瞬时转化方法研究GmFT5a基因，该方法具有快速准确的特点。通过克隆GmFT5a基因启动子片段，将GmFT5a基因启动子与LUC基因融合构建融合表达载体并转化烟草，将注射菌液的烟草分别作长短日照处理，进而分析GmFT5a启动子瞬时表达活性，结果表明无论是日照条件长短，GmFT5a启动子均驱动LUC基因优势表达。经长短日照处理后4 h与12 h 取材得到结果一致，均为在短日照条件下GmFT5a启动子表达活性高于长日照条件下GmFT5a启动子表达活性。由此推断短日照诱导GmFT5a基因启动子表达，GmFT5a受日长调节。进一步确定GmFT5a 是光周期调控因子，并通过PLANTCARE 启动子在线预测分析工具分析GmFT5a 基因启动子上存在5 种光响应元件，可初步推断GmFT5a 可能通过启动子顺式元件调控光周期。

通过瞬时转化方法初步判断短日照诱导GmFT5a 启动子表达，但具体是GmFT5a 启动子区域哪个元件响应短日照，GmFT5a启动子是否具有多态性，需进一步研究，本文仅初步证明GmFT5a启动子被短日照诱导，启动子上含有光响应元件，再一次证明GmFT5a是光周期调节因子。GmFT5a是短日照作物大豆适应长日照环境的关键基因，研究为提高不同品种大豆产量提供理论依据。