大豆GmVIT1克隆及耐盐功能分析

李永光，景 雅，孙铭阳，张沿政，苌兴超，陈 龙，李文滨

（东北农业大学农学院，哈尔滨 150030）

大豆作为最重要的全球经济作物之一，多年来受盐碱等逆境胁迫影响。高盐可造成大豆植株渗透势降低，水分吸收减少，营养元素吸收不平衡，进而导致离子毒害及次级氧化胁迫等[1]。因此，挖掘大豆中相关耐盐功能基因，对于提高大豆植株耐盐能力，增强大豆环境适应性、提高大豆产量具有重要意义。

高盐胁迫下，大豆植株地上部分铁离子含量增高[2]。为平衡植物体在代谢调控期间铁离子含量，液泡除含大量细胞代谢过程中的基本物质，还可贮存并转运铁离子[3]。液泡铁离子转运蛋白家族（Vacuolar iron transporters family）将铁离子于液泡和细胞质中相互转运，调节细胞中铁离子含量[4]。当细胞中铁离子含量较高时，VITs可将铁离子转运至液泡中，保持胞内离子含量尽量处于最佳生理范围，维持细胞正常生长，防止细胞发生功能性障碍损伤[5]。

VITs 普遍存在于生物体内，各成员间序列较为保守，相似度较高[6]。VITs 中首先被发现的是酵母CCC1（Ca2+-sensitive cross-complementer 1），该基因编码的蛋白介导Fe2+和Mn2+进入液泡[7]。当CCC1 在酵母中过表达，液泡中铁离子浓度增加，在CCC1缺失的酵母ΔCCC1突变体中，液泡内铁离子浓度下降[8]。酵母CCC1 在拟南芥中的同源基因为AtVIT1，其编码的蛋白与酵母CCC1 蛋白相似度高达58%[9]。AtVIT1 定位在液泡膜上，在维管束组织中高表达，且在胚胎和种子发育过程中大量表达[10]。AtVIT1在水稻中的两个同源基因OsVIT1和OsVIT2 被证明可调控旗叶和种子之间的铁离子转运[11]。

前期转录组测序结果显示，大豆GmVIT1 是被抗逆境转录因子NFYB调控的下游基因，对大豆抗逆境研究具有重要意义。GmVIT1 是VITs 家族成员，位于20 号染色体上，GmVIT1在拟南芥中的同源基因是AT3G43660。本研究利用荧光定量PCR技术分析GmVIT1在盐胁迫及外源ABA诱导下的表达模式，分析转基因毛状根及转基因拟南芥耐盐性，发现GmVIT1可增强转基因植株耐盐能力。这一结果有助于进一步了解GmVIT1在大豆耐盐响应机制中的作用，为大豆分子育种深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

大豆品种“垦丰16”由东北农业大学大豆研究所提供；引物合成及DNA 测序由华大基因公司完成；大肠杆菌感受态Trans-T1、T4连接酶、Trizol、cDNA第一链合成及荧光定量试剂盒购自天根生化公司；农杆菌感受态EHA105 及K599 发根农杆菌感受态购自上海唯地生物技术有限公司；胶回收和质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；高保真SF酶购自Vazyme 公司；CTAB 法提取DNA 所用药品均购自AMRESCO公司。

1.2 GmVIT1生物学信息分析

Phtozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）查找GmVIT1ORF 及氨基酸序列；NCBI 预测GmVIT1保守结构域并检索同源基因，DNAMAN软件比对氨基酸序列，MEGA 7.0构建系统进化树。

1.3 GmVIT1克隆

在phytozome 数据库中查找GmVIT1 转录本序列，利用Primer5.0 设计克隆引物（见表1）。Trizol法提取大豆垦丰16 叶片RNA，以反转录后cDNA文库为模板，SF 高保真酶作PCR 扩增。胶回收目的条带并与优化后的pCXSN 表达载体T4连接。转化Trans-T1大肠杆菌感受态后挑取阳性克隆测序。

1.4 转GmVIT1拟南芥筛选

提取重组质粒pCXSN-GmVIT1 并转入农杆菌EHA105。选择阳性菌株侵染拟南芥花序，获得T0代转基因植株。在含5 mg·L-1PPTMS培养基中筛选T1代，并将阳性苗移入土中（土：蛭石=2：1）。待植株长至8～10 叶，CTAB 法提取叶片DNA 目的基因PCR鉴定（鉴定引物与克隆引物相同)并收获，继续繁殖至T3代植株。

1.5 GmVIT1 在不同处理及组织中的表达模式分析

1.5.1 高盐及外源ABA处理

挑选垦丰16大豆种子播种于土壤，25 ℃（光周期为16 h/8 h）温室培养。待第二个三出复叶完全展开，将植株根部洗净并分别浸泡于含150 mmol·L-1NaCl 及100 μmol·L-1ABA 处理液中，以蒸馏水为对照。剪取150 mmol·L-1NaCl 和对照处理0、2、4、8、12、24和36 h叶片，剪取100 μmol·L-1ABA和对照处理0、4、6、12、24和48 h叶片，放入液氮速冻并迅速转移至-80 ℃冰箱。提取RNA并反转录，作荧光定量PCR。利用Primer 5.0 设计定量引物（见表1）。

表1 研究所用引物序列Table 1 Primers used in the study

1.5.2 组织特异性分析

播种后25 ℃（光周期为16 h/8 h）温室培养。随着大豆生长发育，剪取根、茎、叶、花、荚、种子放入液氮速冻并迅速转移至-80 ℃冰箱。提取RNA并反转录，作荧光定量PCR。

1.5.3 数据分析

每个试验设置3 次生物重复，内参基因为GmActin4，2-ΔΔCT计算基 因相对表达 量，GraphPad Prism 5分析显著性并绘制柱形图。

1.6 GmVIT1蛋白亚细胞定位分析

使用引物YFP-GmVIT1-F 及YFP-GmVIT1-R扩增获得含有部分YFP 载体序列的GmVIT1，infusion 法将其构建到YFP 载体上获得重组载体35S:YFP::GmVIT1，转化Trans-T1大肠杆菌感受态后挑取阳性克隆测序。通过PEG 转化法将重组质粒35S:YFP::GmVIT1 转化到拟南芥原生质体中，22 ℃培养18 h，使用激光共聚焦显微镜观察黄色荧光并分析定位情况。所需引物见表1。

1.7 转GmVIT1大豆毛状根的获得及耐盐性分析

将重组载体pCXSN-GmVIT1 及空载体pCXSN转入发根农杆菌K599 感受态细胞中，选择阳性菌株诱导并鉴定大豆毛状根。将长势一致毛状根置于含150 mmol·L-1NaCl蒸馏水中处理，以水处理为对照，25 ℃（光周期为16 h/8 h）培养7 d，观察表型并记录根长。所有表型均设置3 次重复，Graph Pad Prism 5分析显著性，并绘制柱形图。

1.8 转GmVIT1拟南芥耐盐性分析

将转基因T3代种子和野生型经10%次氯酸钠灭菌处理后，种于含0、75、100及150 mmol·L-1NaCl的MS培养基，24 ℃组培室培养，每天观察并记录转基因与野生型拟南芥萌发及绿化情况。

种灭菌后转基因T3代种子及野生型播种于MS培养基，24 ℃组培室培养5 d，将拟南芥幼苗移入含0、75、150及200 mmol·L-1NaCl MS培养基，培养1周左右，观察并测量转基因与野生型拟南芥根长。

种灭菌后转基因T3代种子及野生型播种于MS培养基，24 ℃组培室培养两周，移拟南芥幼苗于土中（土：蛭石=2：1），1周后，隔天浇灌1次0.8 mol·L-1盐水，处理1周，观察并记录转基因与野生型拟南芥表型，随后正常复水，观察转基因与野生型拟南芥恢复状况。

2 结果与分析

2.1 GmVIT1克隆及序列分析

根据phytozome数据库查询获得GmVIT1转录本序列，提取大豆RNA 并反转录成cDNA，利用GmVIT1的CDS全长引物作PCR扩增，得到1 073 bp单一条带（见图1）。经测序确定从大豆垦丰16中克隆获得GmVIT1 序列与数据库一致，cDNA 序列全长660 bp，编码219个氨基酸，蛋白比对结果表明GmVIT1 含有液泡铁离子转运蛋白保守结构域CCC1（见图2）。

2.2 GmVIT1同源蛋白分析

在NCBI-BLAST 中比对GmVIT1 氨基酸序列，发现野生大豆、木豆、绿豆等13 个物种中VIT 基因的氨基酸序列与GmVIT1 相似度较高。GmVIT1（Glycine max，XP_006606162.1）与野生大豆（Glycine soja，KHN17004.1）相似度高达92%；与木豆（Cajanuscajan，XP_020232118.1）相似度达87%；与绿豆（Vigna radiatevar，XP_014512558.1）相似度为88%，同源性相对最低的为拟南芥，相似度为72%。DNAMAN 多重比对结果与BLAST 结果一致，且均含有保守结构域VIT1，体现VITs 家族序列保守性（见图3）。

利用MEGA 7.0 将GmVIT1 氨基酸序列与以上13 个基因氨基酸序列整合生成系统进化树（见图4），结果表明，GmVIT1属于VITs家族成员，与野生大豆亲缘关系最近。

2.3 GmVIT1蛋白亚细胞定位

利用PEG 转化法将重组质粒35S:YFP::GmVIT1转化至拟南芥原生质体中，光照培养18 h，使用激光共聚焦显微镜观察黄色荧光蛋白（见图5）。结果显示，在注射空载体的细胞中，黄色荧光在细胞各组分中均有分布，而注射重组载体35S:YFP::GmVIT1细胞中，黄色荧光仅分布在液泡膜上，表明GmVIT1为膜定位蛋白，定位在液泡膜上。

2.4 大豆GmVIT1表达模式分析

利用荧光定量分析GmVIT1 在大豆不同组织中的表达量（见图6），结果表明GmVIT1 在大豆组织中表达量由高到低为花、荚、叶、根、茎、种子。花中表达量为种子的100 倍。在外源ABA 诱导下，GmVIT1的mRNA丰度随处理时间延长而逐渐降低，在诱导24 h时，GmVIT1表达量最低，是诱导前的1/2000倍；在NaCl处理下，GmVIT1的mRNA积累在2 h达到峰值，为处理前的57倍，随后逐渐降低。结果显示，GmVIT1 的mRNA 转录受ABA 负调控，且受盐胁迫诱导上调表达，进一步表明该基因参与植物耐盐胁迫及ABA响应途径。

2.5 转GmVIT1大豆毛状根耐盐性分析

为确定GmVIT1 差异表达对大豆耐盐性影响，利用发根农杆菌K599 作大豆毛状根试验。通过转化获得表达GmVIT1 基因的毛状根，将长势一致毛状根置于含150 mmol·L-1NaCl的水中处理，以水处理为对照，处理7 d 后（见图7），转空载体大豆毛状根地上部分比转基因大豆毛状根更萎蔫，长势矮小，且转GmVIT1 基因大豆毛状根增长量是对照的2～3 倍，表明在根部过表达GmVIT1 提高大豆耐盐胁迫的能力。

2.6 转GmVIT1拟南芥耐盐性分析

利用花絮侵染法转GmVIT1 基因拟南芥，T1代转基因拟南芥鉴定见图8。选取3 个转基因T3代拟南芥株系，荧光定量PCR（qRT-PCR）分析GmVIT1在3 个转基因株系中表达量（见图9）。结果显示，GmVIT1在转基因株系1中表达量最低，株系3中其次，株系2中最高，且GmVIT1在株系2中表达量是株系1的14倍，株系3的2倍。

利用不同浓度NaCl 处理转基因拟南芥，分析拟南芥在盐胁迫下的萌发、子叶绿化及根系表型。萌发和子叶绿化结果显示（见图10A），正常MS 培养基中，转基因拟南芥萌发和绿化与野生型无明显区别。随NaCl 浓度增加，拟南芥生长受抑制，但转基因拟南芥萌发和绿化均高于野生型。NaCl 浓度为100 mmol·L-1，转基因拟南芥3 个株系萌发率分别是野生型拟南芥的1.09、16.93 及12.7倍，绿化率分别是野生型拟南芥的1.5、3.62 及1.98倍。盐胁迫下根长结果显示（见图10B），在正常MS培养基中，转基因拟南芥和野生型拟南芥均正常生长。盐胁迫下拟南芥生长受抑制，但转基因拟南芥根长在不同浓度NaCl 胁迫下均长于野生型拟南芥。

土壤盐胁迫试验显示（见图11），随800 mmol·L-1NaCl 处理时间延长，野生型拟南芥逐渐萎蔫，大部分叶片失绿枯死，存活率22%，而转GmVIT1 基因拟南芥少数叶片叶边缘逐渐失绿发白并枯死，3个株系存活率分别为66%、87%及73%。

3 讨论与结论

盐胁迫对植物产生危害主要为离子胁迫、渗透胁迫和氧化胁迫[12]。在盐渍化土壤中，植物体内离子含量也受盐胁迫影响[13]。大豆在受到盐胁迫时，植株地上部分铁离子含量升高[2]。因此，调控植物体内铁离子含量可能提高大豆植株耐盐能力。液泡铁离子转运蛋白VITs 可将细胞质内过量铁离子转运至液泡中以维持胞内离子含量处于最佳生理范围，保证细胞正常生长[11]。

本试验在大豆中克隆获得GmVIT1基因，其蛋白序列含有类CCC1结构域。DNAMAN多重比对结果显示，GmVIT1 蛋白序列与不同物种VIT 基因蛋白序列相似度较高，且均含有VIT1 保守结构域。系统进化树分析表明，GmVIT1 属于VITs 家族成员。TAIR网站显示，GmVIT1在拟南芥中同源基因为AT3G43660，二者同源率高达77%。研究表明，AT3G43660 蛋白序列与AtVIT1 高度同源，含有类CCC1 结构域，参与植物细胞中铁离子运输[14]。VITs 家族的AtVIT1[6]、TgVIT1[15]及OsVIT1[11]均定位在液泡膜上。亚细胞定位结果表明，GmVIT1定位在液泡膜上，表明GmVIT1为VITs家族成员，参与液泡与细胞质间铁离子转运。

ABA 调控盐胁迫分为ABA 依赖和非ABA 依赖两种途径[16]。目前，已知参与ABA 依赖途径调控植物盐胁迫的基因有GmMYBs[17]、GmWRKYs[18]及GmbZIPs[19]等。分析GmVIT1 在外源ABA 诱导下的表达模式，GmVIT1 负响应ABA 诱导，表明GmVIT1可能通过ABA依赖途径参与盐胁迫；在盐胁迫下发现GmVIT1 受盐胁迫诱导上调表达。GmVIT1在大豆各组织表达与Cao等[20]研究结果，在大豆根、茎、叶及花等组织中均表达，且表达量差异较大，在花中表达量最高。

将GmVIT1在大豆毛状根中过表达，分析转基因大豆毛状根耐盐性，发现单独在根系中过表达GmVIT1 可保障根在盐胁迫下生长，增加大豆根系耐盐能力，从而保证地上部分正常生长，因此转GmVIT1 大豆毛状根地上部分长势好于转空载体。将GmVIT1在拟南芥中过表达，分析转基因拟南芥耐盐性，发现在拟南芥中整株表达GmVIT1可提高植株整体耐盐性。结果表明大豆GmVIT1在不同组织中均参与植株耐盐响应，在大豆耐盐方面发挥重要作用。

周荣芳等通过分析VITs 家族启动子区域发现，VIT 基因可能参与植物抗胁迫过程[8]。通过前期分析GmVIT1启动子发现，GmVIT1启动子上含有1 个MYB 结合位点以及其他与逆境相关的作用元件。推测GmVIT1可能通过启动子元件CCAAT-box与MYB 转录因子结合，参与MYB 调控盐胁迫途径。因此，后续应通过大豆遗传转化、蛋白互作及其他分子生物学试验，验证GmVIT1参与的调控途径及其具体功能。