中草药添加剂对鲁氏耶尔森菌感染虹鳟血液生化指标的影响

冯淇元，陆绍霞，徐 喆,4，王亚玲1,，李芳源,4，刘红柏

(1.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306；2.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，哈尔滨 150070；3.上海海洋大学农业农村部鱼类营养与环境生态研究中心，上海 201306；4.南京农业大学无锡渔业学院，江苏无锡 214081)

虹鳟(Oncorhynchusmykiss)为世界性主养冷水鱼类，富含不饱和脂肪酸、蛋白质、维生素、矿物质及微量元素等，已成为人类获得重要营养的膳食之一[1]。虹鳟在养殖过程中面临病原菌入侵[2]、密度过高[3]、温度异常[4]、滥用药物[5]的危害，这对其摄食、代谢、繁殖等有很大影响，甚至引起大规模的死亡。鲁氏耶尔森菌(Yersiniaruckeri)是导致虹鳟患肠炎红嘴病(enteric redmouth diseases,ERM)的主要致病菌，患病鱼具体表现为体表变黑、眼球突出、下颌部点状出血。该菌对各生长阶段的虹鳟鱼均可造成影响，尤其在虹鳟苗种阶段由于其抵抗力差，造成的细菌性应激损伤更为严重[6]。

长期使用抗生素防治鱼病会促使药物残留于水体[7]，导致细菌耐药性增强，严重影响水产养殖健康发展[8,9]。中草药作为水产动物抗应激添加剂的重要来源，具有抗菌、抗应激和提高机体免疫力等作用，杨移斌等[10]研究乌梅、地榆和杞子提取液对鲁氏耶尔森菌的最小抑菌浓度，发现乌梅对鲁氏耶尔森菌有良好抑菌效果。Baba等[11]用添加橄榄叶(OleaeuropeaL.)提取物的饲料投喂虹鳟，发现橄榄叶提取物可有效降低感染鲁氏耶尔森菌虹鳟的死亡率，且与对照组相比，在感染鲁氏耶尔森菌后脾脏中免疫基因的表达显著上调。

中草药的种类繁多，但存在单方使用量大和成本高的局限[12]，复方可根据机体和作用目的不同进行配伍，利用其相互间的协同或拮抗作用，提高药物疗效或减少不良反应[13,14]。目前，已有中草药对虹鳟免疫、热应激方面的研究[15,16]，而复方中草药对虹鳟抗细菌性应激方面的研究却未见报道。本实验通过检测两种复方中草药对鲁氏耶尔森菌感染后虹鳟血液生化指标等变化，为进一步研究抗细菌性应激中草药添加剂提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

健康、非免疫虹鳟(15±1)g购自辽宁省本溪市艾格莫林虹鳟养殖场；实验用中草药购自哈尔滨宝丰药店，研磨粉碎后待用。

1.2 方法

1.2.1 中草药方剂及药料的制备

实验所用复方1和复方2的质量各按照表1进行称取，将配伍好的中草药在砂锅中浸泡30 min，加热熬煮45 min后过滤倒出，再加清水熬煮30 min，合并两次药汁用电炉加热浓缩药物至1 g/mL，存放于4 ℃冰箱，根据药物在饲料中添加量拌入全价基础饲料。添加剂量的确定是根据各药常用剂量及配比后的协同作用加减而来。

表1 实验用复方配方和饲料中的药物添加量Tab.1 Chinese herbs compounds of formulation and compounds content in fodder

1.2.2 养殖实验

实验分为对照组，复方1组和复方2组，养殖实验期间均未攻毒，每组三个平行，每个平行40尾鱼，水温(15±1)℃，溶氧10 mg/L以上，虹鳟全价基础饲料预饲2周。正式实验期间，每天按鱼体质量的3%投喂，对照组投喂不含中草药的基础饲料，日投喂3次，连续投喂28 d。养殖实验开始前和结束后，对各组鱼称重，用于计算增重率。

W=100%×(Wt-W0)/W0

式中，W为增重率(%)，Wt为终末体质量(g)，W0为初始体质量(g)。

1.2.3 攻毒实验及存活率统计

参考连浩淼等[17]用改良寇氏法计算72 h内虹鳟半致死菌液浓度为1.9×107CFU/mL。养殖实验结束后，将对照组、复方1组和复方2组分为不攻毒组和攻毒组。对攻毒组鱼用间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS-222)快速麻醉后腹腔注射0.1 mL浓度为1.9×107CFU/mL鲁氏耶尔森菌，对应转移至毒理实验专用玻璃缸内(0.90 m×0.50 m×0.45 m)。此外，对不攻毒组鱼腹腔注射0.1 mL无菌蒸馏水。根据张枭等[18]构建的虹鳟病理模型，统计感染后72 h各组的存活率作为虹鳟抗鲁氏耶尔森菌感染的指标。

SR=100%×Nf/Ni

式中，SR为存活率(%)，Nf为终末鱼尾数，Ni为初始鱼尾数。

1.2.4 样品采集

捞取各组感染前和感染后活鱼9尾，于间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS-222)溶液中快速麻醉，用2 mL注射器采集尾部静脉血液至1.5 mL离心管中，4 ℃静置过夜后，4 ℃、4 000 r/min离心15 min，吸取上清液即为血清。血清保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.2.5 血清生化指标分析

采用Beckman公司生产的CYNCHRON CH4 PRO全自动生化分析仪进行血清的检测。检测指标包括总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、白蛋白与球蛋白比(ALB/GLO)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、谷草转氨酶与谷丙转氨酶比(AST/ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)、总胆红素(TBIL)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TCH)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、尿酸(UA)、血糖(GLU)。

1.2.6 数据处理

实验数据采用SPSS 23.0统计软件中的单因素方差分析(One-way analysis of variance,ANOVA)进行统计，采用邓肯氏法进行多重比较，P<0.05为显著性判别标准。数据以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 饲喂不同复方中草药对虹鳟增重率的变化

由表2可知，投喂28 d后，复方1和复方2组虹鳟的平均终末体质量与对照组相比无显著性差异，复方1组和复方2组虹鳟增重率与对照组相比无显著性差异，但复方中草药组增重率高于对照组，说明两种复方中草药对虹鳟增重无不良影响。

表2 饲喂不同复方中草药后对虹鳟体重的影响Tab.2 The effects of different Chinese herbs compounds on the weight of O.mykiss

注：同一列标有不同字母的数值表示差异显著(P<0.05)；标相同字母的数值表示差异不显著(P>0.05)。下同。

2.2 人工感染虹鳟存活率的变化

对各组鱼腹腔注射0.1 mL 1.9×107CFU/mL的鲁氏耶尔森菌，观察各组虹鳟72 h内存活情况。由图1可知，复方中草药在投喂28 d后，能明显提高虹鳟对鲁氏耶尔森菌的抵抗力。对照组攻毒后，存活率为47.5%，复方1攻毒组与攻毒对照组和复方2组相比，存活率无显著性差异。其中，复方2攻毒组存活率为57.5%，显著高于攻毒对照组。

图1 不同中草药对感染鲁氏耶尔森菌后的虹鳟存活率的影响Fig.1 Effects of different Chinese herbs compounds on the survival rate of O.mykiss infected with Y.ruckeri

2.3 饲喂不同复方中草药对虹鳟血清生化指标的变化

2.3.1 虹鳟血清中蛋白含量的变化

由表3可知，攻毒后，各组TP、ALB和GLO含量相比攻毒前均有所降低，但复方2组TP、ALB和GLO含量明显高于攻毒对照组。各组攻毒后白球比例无显著性差异，但复方2组比值略高于对照组。

2.3.2 虹鳟血清中部分酶活性的变化

由表4可知，复方2组缓解鲁氏耶尔森菌引起的应激效果较好。攻毒后，复方2组ALT活性低于对照组，两组复方AST活性均低于对照组，对照组ALP活性降低了77.11%，复方1组降低了85.93%，复方2组降低了57.09%，复方2组的下降幅度小于对照组，且复方2组ALP活性明显高于攻毒对照组。攻毒对照组LDH活性升高为原来的1.31倍，复方1组LDH活性虽有所升高，但低于攻毒对照组。复方2组LDH活性相比攻毒前降低了39.77%。

表3 饲喂不同复方后虹鳟血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白及白/球蛋白比例的变化Tab.3 The contents of total protein,albumin,and globulin,and the ratio of albumin content to globulin content in the serum of O.mykiss by different Chinese herbs compounds

表4 饲喂不同复方后虹鳟血清中部分酶活性的变化Tab.4 The changes of enzyme activity in serum of O.mykiss fed with different Chinese herbs compounds U/L

2.3.3 虹鳟血清中总胆红素、尿素氮、肌酐和尿酸含量的变化

由表5可知，复方中草药组对肾脏具有一定保护效果。攻毒后，两个复方组TBIL、BUN和CREA含量与对照组相比无显著差异，UA含量均显著低于攻毒对照组。

2.3.4 虹鳟血清中甘油三酯、总胆固醇和血糖含量的变化

由表6可知，攻毒后，两个复方组TG和TCH含量与对照组相比无显著性差异。但复方1组TG含量低于对照组，复方2组TG含量高于对照组，复方1组TCH含量低于对照组，复方2组TCH含量高于对照组。各组攻毒后血清葡萄糖含量无显著性差异。

表5 饲喂不同复方后虹鳟血清中总胆红素、尿素氮、肌酐和尿酸含量的变化Tab.5 The contents of total bilirubin,urea nitrogen,creatinine and uric acid in the serum of O.mykiss by different Chinese herbs compounds

表6 饲喂不同复方后虹鳟血清中甘油三酯、总胆固醇和血糖含量的变化Tab.6 The contents of triglycerides,total cholesterol and blood glucose the serum of O.mykiss by different Chinese herbs compounds mmol/L

3 讨论

自然条件下鲁氏耶尔森菌通过鱼鳃和皮肤从血液扩散到其他组织[19]，而腹腔注射是常用的血源性感染细菌的方式[20]，因此，本实验选取腹腔注射的方式来绕过体表防御机制。

黄芪能够改善动物由中毒引起的应激，维持细胞膜及亚细胞结构的完整性，由金银花、半枝莲和扁蓄等醇提而成的药液可通过延长细菌对数生长期的方式抑制其生长繁殖[21]。陶健等[22]采用二倍稀释法研究了16种中药单方及5种复方对鲁氏耶尔森菌的最小抑菌浓度，发现黄芩抑菌效果最好，其MIC均为0.028 g/mL。而大黄、黄柏、黄芩复方按5∶3∶2的配比对鲁氏耶尔森菌的抑菌效果最佳，其MIC为0.057 g/mL。因此，本实验选取黄芩、大黄、黄柏等中草药作为预防细菌性应激损伤的实验药物，其抑菌作用机理主要体现在对免疫器官、细胞及体液免疫的调节和对细胞因子的影响上。其中起调节机体免疫功能的成分主要有多糖、生物碱、蒽类、挥发油、有机酸等，主要通过抑制细菌细胞壁合成、破坏细胞膜通透性、干扰蛋白质和核酸合成等方式起到抑杀病菌的作用[23]。此外，中草药有效成分也可激活网状内皮细胞及补体，诱生多种细胞因子来调节鱼体免疫力，进而起到防控目的[24]。

3.1 中草药复方对虹鳟生长和抗鲁氏耶尔森菌感染的影响

中草药添加剂不仅能提高水产动物免疫力，还具有促生长，提高营养价值的作用[25]。本实验中，投喂28 d中草药复方后，复方组的增重率与对照组相比无显著差异，说明饲喂两种复方添加剂对虹鳟机体增重方面无抑制作用。

复方1组和复方2组在感染鲁氏耶尔森菌后存活率均高于攻毒对照组，且复方2组存活率显著高于攻毒对照组，复方1组存活率次之，攻毒对照组最低。表明两种复方中草药饲料添加剂能够增强鱼体感染鲁氏耶尔森菌的抗应激能力，且复方2组效果较好。Adel等[26]在虹鳟饲料中补充刺荨麻(Urticadioica)植物提取物，用鲁氏耶尔森氏菌感染后观察到饲喂不同水平的植物添加剂的实验组死亡率在20%～50%，且添加3%刺荨麻的实验组死亡率最低，具有最高的抗性。Bulfon等[27]在虹鳟饲料中添加人参提取物进行了为期10周的投喂，鲁氏耶尔森氏菌侵染实验表明添加人参提取物的实验组死亡率更低。本实验中草药提高实验组存活率的结果与这相似。

3.2 中药复方对虹鳟血清生化指标的影响

3.2.1 复方中草药对虹鳟血清蛋白含量的影响

血清生化指标反映鱼体的健康状况，营养水平和生理状态，鱼体在应激环境中的变化必然会体现在血液中[28]。血液中总蛋白(TP)反映机体对蛋白质的吸收、合成、分解等代谢状况。血清白蛋白(ALB)可以结合和运输内源性与外源性物质，具有维持血液渗透压，清除自由基，抗凝血等生理功能，而球蛋白(GLO)在一定程度上反映机体的免疫功能[29]。此外，肝脏是合成蛋白质的重要器官，肝细胞受损尤其影响ALB含量的降低[30]。纪利芹等[31]用添加β-葡聚糖的饲料饲喂虹鳟后，进行杀鲑气单胞菌人工感染实验，发现各攻毒组较攻毒前TP含量显著降低。徐晓津等[30]用哈维氏弧菌感染大黄鱼，研究发现病鱼组蛋白含量均极显著低于对照组。这与本实验研究结果相一致，究其原因可能是被感染鱼体自身消耗蛋白质，并且伴随肝脏受损而蛋白质合成功能减退。本实验组复方2攻毒后蛋白含量降低幅度小，且ALB含量明显高于对照组，说明复方2对由鲁氏耶尔森菌感染引起的肝脏损伤具有一定的保护作用。这种作用可能是复方2中含有的多糖、有机酸等营养活性物质，促进了细胞增殖和蛋白质的合成，抑制细胞凋亡，从而提高机体免疫和抗应激能力[32]。

3.2.2 复方中草药对虹鳟血清部分酶活性的影响

谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)是肝脏中重要的指示酶，正常情况下，血清中转氨酶活性较低，当机体受到应激损伤或者肝脏等组织发生病变时，细胞通透性增大，细胞破裂导致胞内酶进入血液，使血清中酶活性升高[33]。夏斌鹏等[33]对虹鳟采取慢性热应激的研究，发现实验组ALT和AST活性随温度的升高而升高，这与本实验结果相似。本实验复方2组感染后ALT活性低于对照组，这可能是由于复方2组抑制了细胞增殖活性的降低，调节多种细胞因子来保护肝细胞受损[13]。提示复方2组在病原菌入侵的情况下能够改善转氨酶活性异常上升，缓解肝脏受损的效果更好。碱性磷酸酶(ALP)可以加速物质的摄取，直接参与机体代谢过程，调控钙磷比、参与合成和分泌蛋白质，为ADP磷酸化为ATP提供更多的无机磷酸[34]。另有文献表明，ALP参与维护肠道微生物的动态平衡，在被致病菌感染情况下可以清除肠道内毒素，对肠道微生态环境具有一定调控作用[35]。本实验中，复方1组攻毒后ALP活性显著降低，而复方2组则显著高于对照组，说明复方2能够有效促进虹鳟在病原菌入侵情况下进行机体代谢，对肠道健康具有一定保护作用。乳酸脱氢酶(LDH)作为一种参与糖酵解和糖异生的重要酶类，大量存在于肾脏中。LDH释放过多会转化为乳酸，乳酸在组织内大量堆积将造成机体pH值下降，对机体营养物质代谢造成影响。本实验中，复方2组LDH活性显著低于对照和复方1组，说明复方2对肾脏具有一定的保护作用。

3.2.3 复方中草药对虹鳟血清中总胆红素、尿素氮、肌酐和尿酸含量的影响

血清中胆红素(TBIL)主要由衰老红细胞破坏后的血红蛋白衍化而来，可作为评价肝组织损伤的指标之一[36]。血液中尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)和尿酸(UA)含量可作为判断肾脏功能受损的指标[37]。而甘油三酯(TG)和总胆固醇(TCH)作为生命代谢的必需物质以不同的脂蛋白形式储存于肝脏等细胞，能够反映机体摄取和合成蛋白的能力[38]。当鱼体受到应激因素影响时，其体内脂肪作为能源物质会被消耗。血糖(GLU)作为一种重要的能源物质，在鱼体中处于一种动态平衡[38]，鱼体健康状况和外界应激因素都会影响鱼体GLU的水平。纪利芹等[31]对饲喂β-葡聚糖的虹鳟进行杀鲑气单胞菌的感染，研究发现，感染杀鲑气单胞菌第4 d后，所有感染组血清TG和TCH含量显著低于初始水平，且各组TG和TCH含量高于对照组，这与本实验结果相似。本研究攻毒后，复方组除UA含量显著低于对照组外，TBIL、BUN和CREA含量无显著差异，复方2组TG和TCH含量感染前后变化幅度最小，说明在细菌感染过程中，复方中草药组对肾脏功能造成的负担较小，对肾脏代谢功能的损伤小，且复方2组一定程度减弱机体应激造成的肝脏损伤。之前的研究结果显示，鱼体处于应激环境时，GLU含量会有所升高。本实验各组在感染鲁氏耶尔森菌后GLU含量均有所降低，各组GLU含量无显著性差异，这可能是由于机体为抵抗细菌应激而将葡萄糖分解为ATP来提供能量，使得血糖水平降低[39]。