上海市售鳜渔药残留现状的调查研究

吴红岩，赵金良，郝月月，朱书琴，周云红

(上海海洋大学，农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心，水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306)

近些年，因渔药违规超标使用引发的食品安全问题，已经引起了人们的广泛关注。2006-2018年，全国共发生水产品质量安全事件172起，其中包括2006年上海多宝鱼(Scophthalmusmaximus)事件、2007年山东多宝鱼事件、2013年青岛甲醛泡小银鱼(Cephalophyllumloreum)等事件[1]。水产养殖中常见的渔用药物可分为禁用渔药、限量渔药和未监管渔药三类。2002年，孔雀石绿(malachite green,MG)和硝基呋喃类(nitrofurans,NFs)已被列入《食用动物禁用的兽药及其化合物清单》，标明在水产品养殖中禁止添加以及在水产品等动物源性食品中不得检出。孔雀石绿是一种有毒的三苯甲烷类人工合成有机化合物，可做染料，也可用于水产养殖杀菌，很容易在鱼类体内累积[2]。在养殖环境中，孔雀石绿极易转化为无色孔雀石绿，并难以消解。在孔雀石绿浓度为1 mg/L的池塘水体中，即使经过360 d的养殖活动，仍能在池塘底泥中检测到无色孔雀石绿的残留[3]。硝基呋喃类药物主要用于水环境消毒，或拌饵投喂以防治细菌性疾病，尤其对肠球菌属等革兰氏阳性菌引起的感染、皮肤和粘膜损伤后的细菌感染具有良好的治疗效果[4]。硝基呋喃类药物及其代谢物在鱼体内的代谢消除规律受养殖种类、给药量及给药次数等的影响，如青石斑鱼(Epinephelusawoara)连续7 d投喂100 mg/kg硝基呋喃类药物饲料，在停药后163 d后仍可检测到代谢物的存在[5]；斑点叉尾鮰(IetalurusPunetaus)连续7 d，每天2次投喂10 mg/kg的饵料，其代谢物AOZ在各组织中的消除至少需要90 d[6]；用呋喃西林2 mg/L药浴杂交鳢(斑鳢Channamaculata♀×乌鳢Channaargus♂)2 d，其代谢物产物SEM需要60 d才能低于0.25 μg/kg的检测限[7]。喹诺酮类(4-quinolones,4-Qs)药物，主要作为厌氧菌、革兰氏阴性菌的抗菌药。一般是溶解后全池泼洒，或是拌料投喂[8]。但喹诺酮类药物属抗生素，可能会促使部分水生细菌产生耐药性[9]，耐药菌和有喹诺酮类残留的水产品都有可能对消费者健康产生不利影响[10]。为此，农业部公告第2292号规定，诺氟沙星为禁用药物，GB31650-2019规定[11]，恩诺沙星、环丙沙星属残留限量药物，二者检出量相加不得超过0.1 mg/kg。亚甲基蓝(methylene blue,MB)是染料的一种，淡水养殖中可用于防治水霉病、红嘴病和小瓜虫病等。已有研究表明，10 mg/L亚甲基蓝药浴日本鳗鲡(Anguillajaponica)0.5 h，64 d后仍能检测到亚甲基蓝及其代谢物[12]，且亚甲基蓝对鱼卵胚胎的发育有一定的毒性作用[13]。目前美国食品监督管理局(FDA)已禁止亚甲基蓝用于食用鱼的养殖，日本《肯定列表》也规定其在水产品中最高限量标准为10 μg/kg，但中国目前对亚甲基蓝在动物源性食品中的限量还没有相关规定[14]。

鳜(Sinipercachuatsi)是我国传统名贵淡水经济鱼类。在养殖生产过程中，鳜很容易受到多种病原生物(原生动物、细菌、真菌和病毒)的侵袭，难以摆脱渔用药物的依赖。由于用药不当，渔药残留问题比较突出，如2013年福建省养殖鳜孔雀石绿75.8 %的检出率[15]、2015年广东省鳜孔雀石绿19.1 μg/kg的检出量[16]、以及2017农业部全国抽检鲜活水产品(鳜)孔雀石绿及其代谢物14.8 %的检出率。因此，鳜被农业农村部列入《2017年农产品质量安全专项整治方案》，“三鱼两药”专项整治对象之一。随着专项整治工作的落实与推进，本实验选取上海地区为监测点，通过对水产品市场中鳜的全年抽样，检测养殖中常见渔药(MG,NFs,4-Qs,MB)的残留情况，了解鳜养殖中的用药现状，以期为鳜水产品的质量安全管理工作提供参考和依据。

1 材料和方法

1.1 主要仪器和试剂

1.1.1 仪器

高效液相色谱仪(安捷伦1100型配紫外荧光检测器，美国安捷伦公司)；N-1300D型旋转蒸发仪(日本EYELA公司)；MDF-U53V型超低温冰箱(日本Sanyo公司)；5417R型高速冷冻离心机(德国Sartorius公司)；YP202N型电子精密天平(上海精密科学仪器有限公司)；DL-360A型超声提取仪(上海之信仪器有限公司)；DS高速匀浆机(佛山市翁开尔贸易有限公司)；Vortex-2漩涡震荡仪(上海沪析实业有限公司)；HSE-12D固相萃取装置(重庆中普科技有限公司)。

1.1.2 试剂

孔雀石绿(CAS:569-64-2)及无色孔雀石绿(CAS:129-73-7)标准品(中国药品生物制品检定所，纯度>98%)；呋喃唑酮(furazolidone,CAS:67-45-8)、呋喃妥因(furadantin,CAS:67-20-9)、呋喃西林(nitrofurazone,CAS:59-87-0)、呋喃它酮(furaltadone,CAS:139-91-3)，对应代谢物：3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)、1-氨基-2-乙内酰(AHD)、氨基脲(SEM)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)的标准品，(美国Sigma公司，纯度≥99 %)；环丙沙星(ciprofloxacin,CAS:85721-33-1)、恩诺沙星(enrofloxacin,CAS:93106-60-6)、诺氟沙星(norfloxacin,CAS:70458-96-7)标准品(北京北纳创联生物技术研究院，纯度≥99.5 %)；亚甲基蓝标准品(美国Sigma公司，纯度≥99.5 %)。

冰乙酸、无水硫酸钠、乙酸乙酯、邻氯苯甲醛、庚烷磺酸钠、甲醇为色谱纯，正己烷、乙酸铵、二甘醇、四丁基溴化铵、磷酸二氢钠、对甲苯磺酸、盐酸羟胺为分析纯，以及中性氧化铝(100-200目)、酸性氧化铝(80-120目)、氢氧化钠、超纯水(≥18 MΩ·cm@25 ℃)、0.22 μm微孔滤膜、0.45 μm微孔滤膜，均购自生工生物工程(上海)有限公司；三氯乙酸为优级纯，异辛烷、乙腈、二氯甲烷、柠檬酸为色谱纯，以及硅胶C18键合材料(100～200目)、吸附性离子交换树脂(100～200目)均购自国药集团化学试剂有限公司；阳离子交换萃取柱(100 mg/3 mL)、酸性氧化铝柱(1 g/3 mL)、中性氧化铝柱(1 g/3 mL)购自武汉敬信科技有限公司；C18-CN净化柱(200mg/3mL)购自武汉市伟琪博星生物科技有限公司。

1.2 样本采集与前处理

1.2.1 样品采集

从2018年4月-2019年3月，每月下旬到上海市某水产批发市场随机购买500 g左右的鳜6尾，密封袋打包充氧，活体运回实验室。去皮后取背部肌肉，并分割成小块，用绞肉机低温绞碎均质，分类封装，置-80 ℃保存待测。

1.2.2 前处理及测定

孔雀石绿及无色孔雀石绿样品的前处理及测定均参照GB/T 19857-2005高效液相色谱法[17]；硝基呋喃类药物样品的前处理及测定均参照GB/T 1007-2008高效液相色谱法[18]；喹诺酮类药物样品的前处理及测定均参照农业部783号公告[19]；亚甲基蓝样品的前处理及测定均参照SN/T 1974-2007高效液相色谱法[20]；

1.2.3 色谱条件

取适量标准品，配制标准溶液，并依浓度梯度分别检测获取保留时间和出峰面积，作定量用。具体检测的色谱条件参数见表1。

表1 检测药物及其代谢产物的色谱条件Tab.1 Chromatographic conditions for detecting drugs and metabolites

注：MG/LMG表示孔雀石绿/隐色孔雀石绿，NFs表示硝基呋喃类，4-Qs表示喹诺酮类，MB表示亚甲基蓝。

1.2.4 质量控制

处理前，清洗均质器等前处理设备，防止污染。在对72份鳜样分别进行10种药物检测的同时，设空白对照。当出现异常结果时，需对该批次样重新测定。

1.3 数据处理

数据处理均采用SPSS19.0软件分析，统计结果均以平均值±标准差的形式表示。

2 结果

2.1 孔雀石绿与无色孔雀石绿

全年共计检测72尾鳜，孔雀石绿、无色孔雀石绿均无检出样(表2)。检测鳜为市场采集，又因孔雀石绿、无色孔雀石绿的代谢周期较长，说明市售鳜在运输和暂养过程中没有孔雀石绿添加，以及当龄鳜违规使用孔雀石绿的可能性也不大。

2.2 硝基呋喃类药物

全年共抽检鳜样品72份，检出率为50 %(36/72)(表2)。呋喃唑酮代谢物(AOZ)、呋喃它酮代谢物(AMOZ)未检出；呋喃西林代谢物(SEM)检出8尾，检出率11.1%，检出平均浓度为(0.49±0.03)μg/kg；呋喃妥因代谢物(AHD)检出32尾，检出率44.4%，检出平均浓度为(3.51±2.27)μg/kg。可以看出，部分秋冬季上市销售的鳜体内含有硝基呋喃类药物代谢物，尤其是AHD的残留量与检出率均较高。说明在鳜生产或流通中仍存在硝基呋喃违禁药物使用现象。

2.3 喹诺酮类药物

全年共抽检鳜样品72份，检出率为76.39%(55/72)(表2)。其中，恩诺沙星检出13尾，检出率18.06%，检出平均浓度为(27.95±4.17)μg/kg；环丙沙星检出51尾，检出率70.83%，检出平均浓度为(20.98±6.85)μg/kg；诺氟沙星检出7尾检出率9.72%，检出平均浓度为(25.52±10.36)μg/kg。从全年看，喹诺酮类药物在4-9月份的检出次数(45个)明显高于其他月份(26个)，平均检出浓度(26.74±5.11)μg/kg与其他月份相似(16.57±2.34)μg/kg。说明喹诺酮类药物中，恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星可能有滥用或休药期不足的风险。

2.4 亚甲基蓝

全年共抽检鳜样品72份，检出率为15.3%(11/72)(表2)。检出平均浓度(123.5±10.1)μg/kg，说明存在亚甲基蓝在水产养殖中使用的现象。因我国未限定亚甲基蓝在鱼类肌肉中的最高限量，故从亚甲基蓝较高的检出量推测，亚甲基蓝在市售鳜的养殖、运输以及销售暂养环节均有可能被添加使用。但亚甲基蓝的添加为单环节或多环节，还有待进一步探究。

3 讨论

3.1 孔雀石绿检测结果特征分析

孔雀石绿在水产养殖中主要用于防治水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等，且易被鱼体迅速吸收到体内不同组织，并转化为毒性大、易残留的无色孔雀石绿[21]。有研究表明，鳜体内孔雀石绿、无色孔雀石绿完全消除分别需要58 d、270 d[22]，几乎涵盖了鳜从受精卵孵化到成鱼上市的全部时长。本实验中，上海市全年市售鳜肌肉中孔雀石绿和无色孔雀石绿均未被检出，表明农业农村部的“三鱼两药”专项整治行动，对解决鳜生产中孔雀石绿的违禁使用问题，效果极其显著。

表2 上海市售鳜渔药2018年4月-2019年3月间检出情况Tab.2 Detection of Mandarin fish fishery drugs on sold in Shanghai market from April 2018 to March 2019 μg/kg

3.2 硝基呋喃类、喹诺酮类与亚甲基蓝药物的检出特征分析

硝基呋喃类原药在动物体内吸收迅速、代谢快、稳定时间短，停药3 d就会低于检测限，但其代谢物却能够与蛋白质稳定结合，长时间残留在动物体内[23]。本实验中，鳜肌肉中呋喃唑酮和呋喃它酮代谢物未有检出，呋喃西林和呋喃妥因代谢物检出率分别为11.1 %，44.4 %，说明在鳜养殖生产中仍存在少量硝基呋喃类药物的违禁使用现象。值得注意的是，本次检出样品集中在当年10月份到下年4月份之间，该上市期的鳜包括一部分早繁鳜，养殖生产期经历了夏秋高温季节，容易引起各种寄生虫病以及细菌性疾病的爆发[24]，因而，在养殖用药中可能存在主动或被动使用违禁药品的现象。这种季节性出现违禁药物的现象，能够为未来的生产监管提供重要线索和依据。

喹诺酮类药物属抗生素，水产养殖中的残留易被消费者摄入，对人体产生健康风险[25]。本研究检测了鳜肌肉中恩诺沙星、环丙沙星以及诺氟沙星三种喹诺酮类药物的含量，其检出率分别为：18.06%、70.83%、9.72%，该结果与烟台市市售鱼类[26]、杭州市市售鱼类[27]相比，处于较高水平。喹诺酮类药物作为限量药物，允许在水产养殖中使用。但在实际使用中，其用药量大小、用药次数以及休药期长短均难以控制。结果显示，环丙沙星全年可检出，恩诺沙星、诺氟沙星只在4-10月份之间检出，同样表现出季节性。一般4-10月份上市销售的鳜多是上一年秋苗繁殖养殖而来，养殖生产期多为冬春季节，水温较低，容易引起部分细菌的爆发[28,29]，为保持养殖成活率以获取市场利润，鳜生产阶段可能存在药物滥用或休药期不足现象。

亚甲基蓝在淡水养殖上可用于防治水霉病、红嘴病、小瓜虫病等。已有研究表明，15 mg/kg亚甲基蓝药浴异育银鲫0.5 h，64 d后仍可在肌肉中检测到亚甲基蓝及其代谢物[12]，但中国目前对亚甲基蓝在动物源性食品中的限量还没有相关规定。本研究中，亚甲基蓝检出率15.3 %，分布在4～9月份，说明鳜的生产流通过程中存在亚甲基蓝的使用现象，应引起注意。