稀有鮈鲫热休克因子1的分子克隆与表达分析

张夕梅，黄 宇，刘 堰

(西南大学生命科学学院淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室，重庆 400716)

热休克因子1(heat shock factor 1,HSF1)是热休克反应中最重要的调节因子，它与热休克基因相应的启动子结合，介导基因转录并促进HSPs的表达[1]。水生生物HSF1的重要性在于它不仅受高温诱导，还受氧化剂、重金属和病原体的影响。Wang等[2]首次克隆了橙斑石斑鱼(Epinepheluscoioides)的HSF1同种型，并研究了热应激、免疫刺激和病毒感染后的转录变化。后续研究克隆了硬骨鱼类如斑马鱼(Daniorerio)，虹鳟(Rainbowtrout)和金鱼(Carassiusauratus)的HSF1[3-5]。但HSF1在稀有鮈鲫(Gobiocyprisrarus)中的研究还未见报道。

稀有鮈鲫作为我国特有的鲤科类，具有体型小，养殖容易，生命周期短，繁殖力强等特点，是毒理学研究的本土模式生物[6]。目前，稀有鮈鲫被用于多种分泌干扰物如多双酚A、有机磷阻燃剂、孕激素、五氯酚等的毒理学研究。

五氯酚(pentachlorophenol,PCP)是一种典型的不易氧化和水解的环境污染物[7-8]，PCP及其钠盐使用范围广，美国环境保护署将其列为优先检测污染物和潜在的致癌物，也是我国优先监测的环境污染物之一[9]。

实验室前期曾对PCP暴露下稀有鮈鲫肝脏中HSP90及HSP70的表达进行了研究，发现HSP90、HSP70对PCP较为敏感，提示这两种HSPs能作为PCP的生物标志物[9-10]。后续的研究也证明了HSP70,HSP90能作为环境污染物的标志物[11-13]，然而HSF1作为调节HSP70、HSP90等热休克蛋白的转录因子，对于环境污染物的评估作用研究较少。已有研究指出镉胁迫后能够增加香鱼(Plecoglossusaltivelis)肝、心和肌肉中HSF1基因表达量，降低脾、肾和鳃中HSF1的表达量，表明HSF1能够参与香鱼镉胁迫应激反应，作为镉污染的生物标志物[14]。HSF1除了作为镉等重金属的生物标志物外，当对暴露于纳米材料的斑马鱼胚胎进行基因组分析后发现，纳米材料也会诱导HSF1的表达量，提示HSF1能够作为纳米材料污染物的生物标记物[15]。因此本研究表征了稀有鮈鲫的热休克因子1(GrHSF1)，并检测了GrHSF1的组织表达以及温度和内分泌干扰物PCP暴露对其mRNA表达的影响，为GrHSF1对环境污染物PCP的评估作用奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

稀有鮈鲫种鱼购于中国科学院武汉水生生物研究所，在本实验室饲养繁殖超过8年，光照周期为白昼∶黑夜=12 h∶12 h，水温控制在23～25 ℃，全部喂养盐水孵化的丰年虫，实验用鱼为孵化45 d的幼鱼。实验前以连续曝气24 h的自来水[DO>5 mg/L，pH:(7.6±1.5)，总硬度为(7.8±0.7)dH，水温(25±2)℃]驯化喂养2周。

1.2 主要试剂

试剂：五氯酚(PCP，纯度99%)，二甲基亚砜(DMSO，色谱纯)，17α-乙炔基雌二醇(EE2，纯度>98%)购自Sigma;Total RNA 提取试剂(DP419)，Prime Script®RT reagent kit with gDNA Eraser，SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ购自Takara；其他试剂均为国产分析纯。PCP和EE2母液以DMSO为共溶剂在蒸馏水中制备，浓度为1 mg/mL，4 ℃保存。

1.3 实验方法

1.3.1 分子克隆

基于NCBI上稀有鮈鲫相近物种的HSF1氨基酸序列信息，在HSF1保守区域设计两个简并引物(HSF1-F，HSF1-R)(表1)，由上海Invitrogen公司合成。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳并观察。通过胶回收试剂盒回收核心片段，亚克隆到pMD19-T载体中，并测序。基于获得的核心片段设计两对基因特异性引物(HSF1-F1，HSF1-F2，HSF1-R1，HSF1-R2)(表1)。根据SMARTerTM RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech，USA)的方案分别合成5′和3′ cDNA模板，选择巢式PCR反应扩增以延伸5′/3′GrHSF1 cDNA序列，于-20℃保存。

1.3.2 序列分析

通过DNAMAN拼接序列全长，通过ProtParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)，计算分子量、理论pI和氨基酸组成；通过ClustalX1.83和SMART软件对稀有鮈鲫的HSF1序列进行多重比对、蛋白质基序特征预测和域结构分析；通过保守域结构检索工具(CDART)、保守域数据库(CDD)以及NCBI检测了稀有鮈鲫HSF1的保守结构域。基于GrHSF1和公共数据库中其他已知HSF1的氨基酸序列。使用邻接法通过MEGA 7.0构建了系统发育树。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers in this research

核苷酸代码：Y=C/T;R=A/G;N=A/C/G/T;M=A/C;S=G/C

1.3.3 暴露实验

基于PCP对稀有鮈鲫七天亚毒性实验[16]以及实验室前期研究，设置4个PCP处理组(n=10)浓度分别为8、16、80、160 μg/L，一个DMSO溶剂对照组(n=10)(0.001% DMSO,v/v)，以及一个阳性对照组(n=10)(EE2,50 ng/L)，全部进行7 d的PCP暴露处理；另取五组，一组(n=50)暴露于80 μg/L PCP不同时间(0、0.5、1、3、5、7 d)，另四组(n=10)分别置于不同温度(4、10、25、37 ℃)的培养箱中7 d，所有暴露体系均在10 L玻璃缸中进行，每个浓度进行两次重复实验。采用半静态水体暴露方法，每天更换一半体积暴露水，再补加暴露试剂至原浓度。每天喂食孵化的丰年虫两次。

1.3.4GrHSF1的组织分布及暴露实验对肝脏HSF1表达的影响检测

从8条未经处理的健康鱼中收集血液、皮肤、鳔、鳍、脾、肝、性腺、鳃、肾、肌肉、脑、心脏和肠，将样品在液氮中快速冷冻，然后在-80 ℃下保存，通过RT-PCR分析。

处理组的稀有鮈鲫经PCP暴露7 d后，将稀有鮈鲫通过冰浴麻醉，迅速解剖取出肝脏。每个处理组中的4条鱼的肝脏分别收集于一个离心管中作为一个样品用于RT-PCR，每处理组各两个样品，每个样品进行3次重复检测。

使用β-actin作为内参基因，Real-time PCR的正向和反向引物列于表1。反应条件为95 ℃保持30 s进行预变性，40个循环:95 ℃ 20 s，61 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，最后一个循环结束后绘制溶解曲线，所有样品进行三次检测.各基因的相对表达量用2-△△Ct表示，扩增达到荧光阈值时的PCR循环次数，记作Ct值.

1.4 统计方法

使用SPSS统计软件22.0进行数据统计分析，所有定量数据均表示为平均值±SEM;以GraphPad prism 7.0绘图，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 稀有鮈鲫HSF1基因的cDNA全长克隆

结果如图1所示，HSF1基因核心片段长度为480 bp(图1A)，5′和3′片段长度分别为879 bp(图1B)和859 bp(图1C)。运用DNAMAN对核苷酸序列进行拼接得到1条2 144 bp 的全长cDNA，包含一个1 581 bp的开放阅读框，编码527个氨基酸；以poly(A)尾截止的296 bp的3′-非编码区(UTR)和位于起始密码子(ATG)上游的119 bp的5′-UTR；分子量为58.4 kDa；等电点4.88；不稳定指数为52.2，表明蛋白质不稳定。将其命名为GrHSF1，并将该序列提交到GenBank(Accession No.MK588748)。

图1 GrHSF1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Electrophoresis of HSF1 from G.rarus amplification by PCRM：DL2000 DNA 标准品;A：GrHSF1核心片段;B：3′ RACE 扩增片段;C：5′ RACE 扩增片段

2.2 稀有鮈鲫HSF1推导氨基酸序列多重比对及相似率分析

运用ClustalX 1.83序列比对软件将稀有鮈鲫HSF1基因编码的氨基酸序列与其它鱼类HSF1基因所编码的氨基酸序列进行比对，发现稀有鮈鲫HSF1基因所编码的氨基酸与其他鱼类所编码的HSF1氨基酸序列相似度高(图2)，稀有鮈鲫HSF1基因所编码的氨基酸与草鱼、鱇白鱼、斑马鱼、鲫和墨西哥脂鲤所编码的氨基酸相似性分别为95%、92%、84%、89%和74%.GrHSF1氨基酸序列相对保守，通过NCBI的CDD进行的序列分析显示，保守区域具有位于残基17-121位的HSF-DNA结合超家族，位于残基75-185位的转移酶超家族及位于残基247-527位的脊椎动物热休克转录因子。

2.3 稀有鮈鲫HSF1系统进化树分析

用Clustal X和Mega 7.0的比邻法建立系统进化树，用1000组复制抽样分析，获得GrHSF1氨基酸序列的系统进化树(图3)。系统进化树包括稀有鮈鲫(Gobiocyprisrarus，MK588748)，草鱼(Ctenopharyngodonidella，ALK27859.1)，斑马鱼(Daniorerio，NP_001300665.1)，鲤(Carassiusauratus，AHN60082.1)，虹鳟(Oncorhynchusmykiss，BAD10988.1)，西洋鲑(Salmosalar，XP_01399 8218.1)，食蟹猕猴(Macacafascicularis，XP_015 310862.1)，斑马拟丽鱼(Maylandiazebra，XP_012 778243.1)，慈鲷(Pundamilianyererei，XP_0137 69204.1)，青鳉(Oryziaslatipes，XP_023815376.1)，马鹿(Cervuselaphushippelaphus，OWK04209.1)，智人(Homosapiens，NP_005517.1)，黑猩猩(Pantroglodytes，NP_001266850.1)，老鼠(Musmusculus，AAH94064.1)，牛(BosTaurus，NP_0010702 77.1)等的HSF1，系统进化树显示GrHSF1与草鱼的HSF1聚为一支，亲缘性较近，之后与其它鱼类聚为一支，与黑猩猩、老鼠、智人等哺乳动物的HSF1亲缘性较远。

2.4 GrHSF1在稀有鮈鲫各组织的分布

用RT-PCR技术检测了稀有鮈鲫体内各组织中GrHSF1的表达状况，发现GrHSF1在稀有鮈鲫血液、脑、性腺、鳃、心脏、肝脏、脾、肌肉、皮肤、鳔、肠和肾等12个组织中有表达(图4)，其中在肝脏中表达量最高，在血液、性腺和脑中也有较高的表达，而在其余组织中表达量较少。

2.5 PCP对稀有鮈鲫HSF1表达的影响

稀有鮈鲫幼鱼在不同浓度PCP暴露7 d后，检测各处理组中稀有鮈鲫肝脏GrHSF1 mRNA的表达情况，实验结果如图5(A)所示，GrHSF1 mRNA的表达量随着PCP浓度的升高而增加，呈现出剂量依赖效应；稀有鮈鲫幼鱼在80 μg/L PCP下暴露不同的时间后，检测各个实验组用鱼肝脏中GrHSF1 mRNA的表达情况，实验结果如图(5B)所示，GrHSF1 mRNA的表达量随着时间的推移而增加，呈现出时间依赖效应;而在热激条件下，GrHSF1 mRNA的表达随着温度的升高或降低而降低，高温对其表达的影响更为明显(图5C)。

图2 稀有鮈鲫HSF1基因预测氨基酸序列的多重比对Fig.2 Multiple sequence alignment of predicted GrHSF1阴影背景为高度保守的一致序列。HSF1的GenBank登录号如下：GrHSF1(Gobiocypris rarus;MK588748)，CiHSF1(Ctenopharyngodon idella ALK27859.1)，AgHSF1(Anabarilius graham;ROL45973.1)，DrHSF1(Danio rerio;NP_001300665.1)，CaHSF1(Carassius auratus;AHN60082.1)，AmHSF1(Astyanax mexicanus;XP_022518071.1)

3 讨论

HSF1是进化上高度保守的转录因子，能够协调应激诱导的转录并指导真核生物的多种生理过程。当环境压力触发HSF1时，HSF1单体聚合在一起并磷酸化，随后转移到核内与热休克反应DNA元件(HSEs)结合，从而上调HSPs的编码。

图3 稀有鮈鲫HSF1系统进化树分析Fig.3 Phylogenetic analysis of HSF1sequences位于分支点的数字表示置信度，重复次数为1 000次。相似物种HSF1的Genbank登录号如前所述

图4 稀有鮈鲫不同组织中HSF1的表达情况Fig.4 Relative HSF1 mRNA expression in different tissue of G.rarus*表示与空白对照组相比P<0.05；**表示P<0.01。图5同。

图5 PCP对稀有鮈鲫HSF1的表达状况分析Fig.5 Effect of PCP on HSF1 mRNA expressions in the liver of G.rarus将稀有鮈鲫暴露于(A)不同浓度的PCP 7天，或(B)80 μg/L PCP不同时间，以及(C)不同温度7天。

在脊椎动物中发现了四种HSF(HSF1-HSF4)，而在无脊椎动物中只报道了一种HSF[17]。不同物种的HSF1同一亚型之间的序列高度相似，不同亚型之间存在结构和功能上的差异[18]。我们首次通过RACE技术从稀有鮈鲫肝脏中克隆得到HSF1的全长cDNA序列GrHSF1(GenBank登录号MK588748)。研究指出GrHSF1序列与鱼类的相似性较高，而与哺乳动物的相似性较差。从进化角度来看，早期进化过程中，HSF1可能在应激过程中发挥着不同的生理功能，这有助于动物更好的适应环境和生存。GrHSF1的mRNA在稀有鮈鲫的不同组织中均被检测到，与之前的海参(Apostichopusjaponicas)[19]，比目鱼(Haliotisdiversicolor)[20]等水生生物中发现的情况是相似的。这一结果表明HSF1对于维持稀有鮈鲫的基础代谢和生长具有重要的意义。HSF1在稀有鮈鲫肝脏中表达量最高，在皮肤，肌肉等中表达量较低，因为肝脏的细胞代谢比皮肤、肌肉等的代谢更活跃，因此我们推测，高表达的HSF1在非压力环境下对于维持细胞蛋白稳定发挥着更为重要的作用，而在压力环境下能够使得热休克反应快速启动。如在低氧和高温下，比目鱼的HSF1的表达水平被上调[20]。还有的研究将斑马鱼经过镉前处理后再经过热处理，其中HSF1和HSF2等转录因子在镉预处理实验组中，对热处理更为敏感，在没有预处理的对照组中，对热处理不敏感，提示我们在寻找生物标志物时应该考虑生物是否有重金属污染史[21]。

在本文的研究中，发现GrHSF1在低于或者高于最适温度时处理七天，其表达量显著下降与以前的研究结论高温胁迫会导致HSF1和HSP90表达量显著上调[20]不一致，与MDBK细胞(Mardin-darby bovine kidnedy 马-达氏牛肾细胞)热激0.5 h或1 h后HSP70转录水平上调，HSF1转录水平下降表达模式一致[22]。对植物的研究中发现，植物进行急性热处理后HSFs表达上调，在慢性热处理中表达几乎不发生改变[23]，对鸡胚成纤维细胞的研究表明不同的HSFs对温度的阈值是不一样的，重度热休克处理导致HSF3的总量增加，HSF1的总量下降[24]，提示不同的HSFs对不同的热处理具有不同的表达模式。除此之外，可能是因为当高温(37 ℃)处理7天后，HSP70,HSP90等热休克蛋白表达量增加达到一定丰度后对HSF1具有反馈抑制作用[25]；也可能是因为长时间的高温处理造成稀有鮈鲫肝脏不可逆的损伤。

通过暴露实验发现GrHSF1与PCP具有时间/浓度效应，在斑马鱼中，HSF1表达与锌也具有浓度效应[26]。在对太平洋南美白对虾(Litopenaeusvannamei)进行硫化物暴露处理时，发现较低浓度(425.5 μg/L)硫化物对HSF1的表达几乎没有影响，较高浓度(851 μg/L)硫化物导致HSF1的表达水平显著提高[27]；在单环刺螠中，硫化物能够以时间依赖的方式提高HSF1的表达，表明硫化物能够以时间/浓度依赖的方式调控HSF1的表达水平[28]。越来越多的研究指出，环境污染物能够在一定程度上调控HSF1，提示我们HSF1能够作为环境污染物PCP的生物标志物。

总的来说，本文首次从稀有鮈鲫肝脏中克隆得到HSF1基因(GenBank登录号：MK588748)并研究了PCP和温度暴露下GrHSF1的表达模式。还需要进一步的研究指出GrHSF1是否能作为其他压力环境下的生物标志物以及GrHSF1的蛋白水平变化，为GrHSF1作为生物标志物提供更多的理论依据。