乙醇沉淀法纯化甜菊糖苷工艺条件优化

王保平，童红梅*，宋巧

甘肃医学院（平凉 744000）

甜叶菊（Stevia rebaudiana（Bertoni）Hemsl）为一种富含甜菊糖苷的菊科植物[1-2]。甜菊糖苷在国际上被誉为“第三糖源”，其甜度约为蔗糖的300倍，热量仅为蔗糖的1/300，是高甜度、低热量的天然甜味剂[3]。甜菊糖苷能使减肥人士、糖尿病患者、高血压患者等忌糖人群摆脱无糖之苦，在第7次国际糖尿病会议上，甜菊糖苷被公认为糖尿病和高血压患者的理想甜味剂[4]。通过大量临床试验，甜菊糖苷安全无毒性得到认证。此外，甜菊糖苷还有降血糖、降血脂、防龋齿、抗肿瘤、利尿等药用价值。甜菊糖苷的价值受到重视，市场需求大，被广泛应用在食品、饮料、医药、日常化工等领域[5]。

甜叶菊中甜菊糖苷约有9种成分，其纯化测定极其复杂。常见的纯化方法有沉淀法、吸附法和膜分离技术[4-6]。沉淀法中，醇沉法相对化学絮凝法损失率低，不会引入其他杂质和无机离子且过程简单，但提取的甜菊糖苷纯度低且颜色深[7]。

试验以甘肃酒泉产的甜叶菊为材料，通过超声提取甜菊糖苷粗提样品，用乙醇沉淀、酸性氧化铝吸附、微孔过滤器膜过滤3种方法协同作用去除样品中杂质，探究甜菊糖苷纯化条件优化对甜菊糖苷得率的影响，以得到纯度较高的甜菊糖苷样品，解决生产中甜菊糖苷提取样品纯度低颜色深的问题。

1 材料与方法

1.1 样品

甜叶菊（购自甘肃省酒泉市肃州区农贸市场，通过肃州区农业局农技科人员鉴别。冷藏于0 ℃的冰箱中备用）。

1.2 仪器与设备

中药超声提取机（JBT/C-YCL500T/3P，山东金百特）；Heidolp旋转蒸发仪（德国）；微孔过滤器天津双吉实验材料经营部）；紫外分光光度计（UV-1780）；101-2型数显电热恒温鼓风干燥箱（上海锦屏仪器仪表有限公司）；JP-1500B高速多功能粉碎机（永康市久品工贸有限公司）；HZK-JA 210电子天平（福州华志科学仪器有限公司）；SHHW600三用电热恒温水箱水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.3 试剂

无水乙醇、氧化铝、蒽酮、浓硫酸（均为分析纯）；甜菊糖苷标准品（STV，纯度＞99.0%，日本和光纯药工业株式会社）。

1.4 方法

1.4.1 甜菊叶预处理将甜叶菊干叶去杂去屑，水洗烘干（40 ℃、60 h）后粉碎粒度0.150～0.180 mm，干燥备用。

1.4.2 甜菊糖苷提取

取1 g冷冻干燥样品，液氮中充分研磨后按加入50%，60%，70%，80%和90%乙醇（料液比1︰50 g/mL），充分混匀后在功率200 W、60 ℃下超声处理40min，反复提取3次，合并滤液，旋转蒸干，对应乙醇体积分数定容后离心去掉沉淀，微孔过滤器膜过滤，取滤液得到粗提液。用蒽酮比色法进行定量分析，采用紫外分光光度计检测甜菊糖苷，按式（1）计算甜菊糖苷提取率。

1.5 结果计算

1.5.1 甜菊糖苷提取率、纯度计算

称取10 g甜叶菊冷冻鲜样，样品提取方法同1.4.2小节，合并滤液并真空浓缩，干燥得粗甜菊糖苷浸膏。取2～3 g粗甜菊糖苷浸膏，置于25 mL容量瓶中，用不同体积分数乙醇超声溶解并定容至刻度线。按照标准曲线的制作方法在最大吸收波长621 nm处测定吸光度，按式（2）计算甜菊糖苷提取率。

式中：X为甜菊糖苷浸膏提取率，%；m1为甜菊糖苷浸膏质量，g；m2为甜叶菊叶质量，g。

式中：Y为甜菊糖苷提取率，%；C为样品甜菊糖苷质量浓度，mg/mL；m3为测得率时称取的粗甜菊糖苷浸膏质量，g；V为样品的体积，25 mL。

式中：Z为甜菊糖苷纯度，%；Y为甜菊糖苷提取率，%；m2为甜叶菊叶质量，g；m3为测得率时称取的粗甜菊糖苷浸膏质量，g。

1.5.2 甜菊糖苷标准曲线绘制

精准称取甜菊糖苷标准品，配制成0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70和0.80 mg甜菊糖苷标准品溶液，置于10 mL容量瓶中，用80%乙醇溶液定容，涡旋混匀后加0.30 mL 1.5%蒽酮溶液、2.00 mL浓硫酸，于80 ℃恒温水浴锅中显色15 min（蒽酮比色法），在621 nm波长处分别测定各反应体系的吸光度。以甜菊糖苷质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线如图1。线性回归方程为y=0.939 8x+0.199 1，相关系数r2=0.998 3。

2 结果与分析

2.1 乙醇体积分数对甜菊糖苷提取率的影响

按照1.4.2甜菊糖苷提取方法制备粗提液，溶于70%乙醇（料液比1︰20 g/mL），充分混匀后以超声功率200 W、提取温度75 ℃超声处理40 min，于80 ℃回流提取1 h，加入1︰5（g/mL）酸性氧化铝，于40 r/min室温振荡60 min，澄清后取上清液，0.3 μm微孔膜过滤。计算甜菊糖苷的提取率与纯度。结果见表1。

图1 甜菊糖苷标准曲线

表1 乙醇体积分数对甜菊糖苷提取率的影响

从表1可以看出，在超声提取条件相同的前提下，选用酸性氧化铝作为吸附剂，振荡吸附60 min，70%乙醇甜菊糖苷的提取率最高，可达26.35%；继续提高乙醇体积分数，甜菊糖苷提取率不但没有升高，反而在下降。由此可知，70%乙醇是提取甜菊糖苷的最佳体积分数。

2.2 料液比对甜菊糖苷提取率的影响

按照1.4.2甜菊糖苷提取方法制备粗提液，用70%乙醇按照料液比1︰20，1︰30，1︰40，1︰50和1︰60（g/mL）加入，充分混匀后以超声功率200 W、提取温度75 ℃超声处理40 min，于80 ℃回流提取1 h，加入1︰5（g/mL）酸性氧化铝，在40 r/min室温振荡60 min，澄清后取上清液，经微孔过滤器膜过滤，用蒽酮比色法进行定量分析，采用紫外分光光度计检测甜菊糖苷，计算甜菊糖苷的提取率与纯度。结果见表2。

表2 料液比对甜菊糖苷提取率的影响

由表2可知，在超声提取条件相同前提下，选用酸性氧化铝作为吸附剂（1︰5 g/mL），振荡吸附60 min，70%乙醇提取甜菊糖苷，选用不同液料比，以料液比1︰40（g/mL）时提取率最高，甜菊糖苷提取率可达26.38%，过大或过小的料液比均不能提高甜菊糖苷的提取率。

2.3 超声功率对甜菊糖苷提取率的影响

准确称取4份1.000 g甜叶菊冻干粗粉，70%乙醇料液比1︰40（g/mL），超声时间60 min，提取温度75℃，分别在超声功率100，150，200，250和300 W下进行超声提取，经微孔过滤器膜过滤抽滤，滤液定容至100.00 mL，移取5.00 mL稀释至100.00 mL，计算甜菊糖苷的提取率与纯度。结果见表3。

表3 超声功率对甜菊糖苷提取率的影响

由表3可知，70%乙醇提取甜菊糖苷，料液比1︰40（g/mL），选用酸性氧化铝作为吸附剂（1︰5 g/mL），振荡吸附60 min，选用不同超声功率，以超声功率200 W时甜菊糖苷提取率最高，可达26.79%，过大或过小的超声功率均不能提高甜菊糖苷提取率。

2.4 提取温度对甜菊糖苷提取率的影响

准确称取6份1.000 g甜叶菊冻干粗粉，用70%乙醇提取，料液比1︰40（g/mL），超声时间40 min，超声功率200 W，分别在提取温度35，45，55，65和75 ℃下进行超声提取，经微孔过滤器膜过滤抽滤，滤液定容至100.00 mL，移取5.00 mL稀释至100.00 mL，计算甜菊糖苷提取率与纯度。结果见表4。

表4 提取温度对甜菊糖苷提取率的影响

由表4可知，用70%乙醇提取甜菊糖苷，料液比1︰40（g/mL），选用酸性氧化铝作为吸附剂（1︰5 g/mL），振荡吸附60 min，超声功率300 W，选用不同提取温度，提取温度65 ℃时甜菊糖苷提取率最高，可达26.57%，过高或过低的提取温度均不能提高甜菊糖苷提取率。

2.5 乙醇沉淀法提取甜菊糖苷重复试验

准确称取3份1.000 g冷冻干样品，液氮中充分研磨后按料液比1︰50（g/mL）加入70%乙醇，充分混匀后超声功率200 W、提取温度60 ℃处理40 min，重复提取3次，将滤液旋转蒸干，用70%乙醇定容后离心去掉沉淀，取滤液得到粗提液，溶于70%乙醇（料液比1︰20 g/mL），充分混匀后以超声功率200 W、提取温度65 ℃超声处理40 min，于80 ℃回流提取1 h，加入1︰5（g/mL）酸性氧化铝，在40 r/min室温振荡60 min，澄清后取上清液，经微孔过滤器膜过滤，滤液用蒽酮比色法进行定量分析，采用紫外分光光度计检测甜菊糖苷，计算甜菊糖苷提取率和纯度。结果见表5。

表5 乙醇沉淀法对甜菊糖苷提取纯度的影响

由表5可知，用70%乙醇提取甜菊糖苷，料液比1︰40（g/mL），选用酸性氧化铝作为吸附剂（1︰5 g/mL），振荡吸附60 min，超声功率200 W，提取温度65 ℃，经微孔过滤器膜过滤，甜菊糖苷提取率均值可达28.81%，甜菊糖苷纯度均值为88.63%。同参考资料相比，甜菊糖苷提取率和纯度均有所提高。

3 结论与讨论

采用乙醇沉淀法提取甜菊糖苷，主要是甜菊糖苷易溶于乙醇，而蛋白质、纤维素等生物大分子不溶于乙醇，从而达到除杂目的；加之乙醇可回收循环利用，降低成本，便于工业生产大规模推广应用。结果表明，利用70%乙醇提取甜菊糖苷，以料液比1︰40（g/mL），选用酸性氧化铝作为吸附剂（1︰5 g/mL），振荡吸附60 min，超声功率200 W，提取温度65 ℃，经0.30 mm微孔过滤器膜过滤，可得甜菊糖苷提取率为28.81%，甜菊糖苷纯度为88.63%，样品颜色洁白，后味不苦[8]。但与商品甜菊糖苷相比（纯度96%以上）还有差距[9-10]，有待进一步优化纯化条件。