HMMR促进原发性肝癌细胞增殖且与不良预后的相关性*

2020-04-20黄晨阳

国际检验医学杂志 2020年7期

黄晨阳，李强，程斌△

(1.浦东新区人民医院检验科，上海 201200； 2.上海交通大学基础医学院，上海 200001)

肝细胞癌占肝癌患者的75%～85%，是最常见的原发性肝癌，其致死率在全球范围内排名第二[1]。肝细胞癌的早期诊断及有效治疗目前仍面临着巨大挑战。虽然有些患者可出现肝癌相关的症状，包括右上腹疼痛、厌食、体质量减轻，以及阻塞性黄疸和骨痛(转移)等[2-3]，但是大多数患者并无明显症状，临床表现通常发生在疾病晚期。因此，研究肝癌发生的相关分子机制及寻找预测早期肝癌患者预后标志物是临床诊治工作中面临的重要问题。研究表明,透明质酸介导运动因子受体(HMMR)在多种肿瘤发生发展中具有重要作用，该分子主要参与细胞运动,在乳腺组织中与BRCA1和BRCA2结合，与乳腺癌发生的高风险有关[4-5]。但是,该分子在原发性肝癌中的研究较少。该文章从临床GEO数据出发，通过生物信息学分析筛选出在肝癌中高表达的基因HMMR，通过基因敲低的方法研究其在肝癌细胞增殖中的影响,同时分析其在早期肝癌预后中的作用。

1 资料与方法

1.1GEO数据库生物信息学分析筛选差异基因下载原始数据：在NCBI主页的搜索下拉菜单中选择GEO DataSets，输入搜索关键词liver cancer，左侧筛选栏中设置感兴趣的Series,Expression profiling by array和tissue,在Top Organisms中选择Homo sapiens，搜索后会显示符合筛选条件的数据集，选择GSE121248数据集，包括107例肝癌患者的临床信息及mRNA基因表达信息，其中70例肝癌组织和37例癌旁组织[6]。下载原始数据Series Matrix Files(CEL格式文件)及临床信息表格；筛选差异基因：将下载得到的原始数据导入Agilent 公司的软件Gene SpringGX,分析得到差异基因，通过设置筛选参数(P<0.05,差异倍数>2),分别得到表达上调和表达下调的差异基因。

1.2预后分析肝癌患者预后分析中的总体生存率(OS)和无复发生存率(RFS)来自于KM-plotter数据库[7]，该数据库收集了364例肝癌患者，具体临床信息包括性别、用药史、是否有肝炎病毒感染史、临床肿瘤分期与分级及服用酒精史。选择目的基因HMMR，设置不同的筛选条件获得生存曲线。

1.3实验仪器及材料

1.3.1实验仪器 BIO-RAD Power Pac Basic电泳稳压仪，TS-8S孵育摇床，其林贝尔TS-1水平摇床，德国Eppendorf公司的冷却离心机，Tanon电泳槽及转膜槽，美国Applied Biosystems公司7300 实时荧光定量PCR仪，Tannon 5200化学发光成像仪，美国Thermo Fisher公司的恒温CO2细胞培养箱和超净工作台。

1.3.2实验材料天根公司的RNA提取试剂盒和反转录试剂盒，Biotool公司的SYBR Green荧光染料实时荧光定量PCR试剂盒，天根公司的电泳液、转膜液及其他配胶试剂，胎牛血清FBS和DMEM高糖培养基购买自Hyclone公司，Gibco公司的双抗(青霉素+链霉素)，Thermo Scientific公司的转染试剂Lipofectamine 2000，RHAMM/CD168(HMMR) Antibody #55463抗体购买自CST，siRNA-HMMR购买自拓然生物。

1.4实验方法

1.4.1细胞转染将HepG2细胞铺板(Hep G2人肝癌细胞，购自中国科学院细胞库，目录号：TCHu72)，待其细胞密度约80%时进行转染。在250 μL Opti-MEM培养基中分别加入5 μL siRNA-HMMR和5 μL Lipofectamine2000转染试剂混匀，将混有siRNA的Opti-MEM滴入转染试剂中，静置20 min后，滴入细胞上清中，4～6 h后换含有FBS的DMEM培养基，48～72 h后检测沉默效率。沉默序列1：TGC TTC AGC TAG AAA AGT T，沉默序列2：TGG ATG AGC TTG ATA AAT T。

1.4.2实时荧光定量PCR 用天根RNA抽提试剂盒提取细胞RNA，将抽提的RNA用反转录试剂盒反转录成cDNA，利用Biotool公司的SYBR Green试剂盒检测HMMR基因的mRNA表达水平。引物序列为HMMR上游引物：5′-ATG ATG GCT AAG CAA GAA GGC-3′，下游引物：5′-TTT CCC TTG AGA CTC TTC GAG A-3′，内参GAPDH上游引物:5′-CTA CAA TGA GCT GCG TGT GG-3′,下游引物5′-CTA CAA TGA GCT GCG TGT GG-3′。采用两步法扩增程序：95 ℃，30 s，1个循环；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，40个循环；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，95 ℃，15 s，1个循环。实时荧光定量PCR结果根据公式2-ΔCt计算得到目的基因HMMR相对于内参基因GAPDH的相对表达量。

1.4.3细胞增殖将转染siRNA-HMMR与对照组细胞分别种到6孔板中，每个细胞种4个复孔，分别在第3天和第5天将细胞消化下来，进行细胞计数，根据细胞数目画折线图。细胞增殖实验根据不同时间消化得到的细胞数目表示细胞生长的快慢，该结果通过折线图表示并计算统计学差异。

1.4.4平板克隆将转染48 h后的siRNA-HMMR细胞与对照组细胞分别种到6孔板中，每孔1×104细胞，待细胞生长5 d后，用PBS冲洗3次，加入1 mL结晶紫染液，摇床染色15 min，用清水冲洗干净，待其晾干后拍照。

1.4.5蛋白免疫印迹(Western blot) 用RIPA裂解液将细胞裂解，收取蛋白，加入2×SDS裂解蛋白后，取20 μg蛋白加入上样缓冲液混匀后100 ℃煮5 min；配置SDS-PAGE胶，60 V，30 min；120 V，60 min进行电泳跑胶；100 V，90 min转膜；5% 封闭1 h后加入一抗4 ℃孵育过夜；加入相应二抗室温孵育1 h后曝光。结果通过ImageJ软件的灰度定量进行相对定量。

1.4.6组织化学及其打分在THPA数据库中下载肝癌患者组织HMMR染色芯片结果及癌旁组织的染色结果，通过免疫组化打分，进行统计学分析。打分方法：阳性百分比×染色强弱。阳性百分比的评判标准：0分,<5%;1分,5%～25%;2分,25%～50%;3分,50%～75%;4分,>75%。染色强弱的评判标准：0分，无、 1分,弱、2分，中等强度、3分，强。总分大于等于2分认为表达阳性。

1.5统计学处理本研究采用GraphPad Prism 5进行统计学做图及分析，两组间的差异比较采用配对样本t检验或独立样本t检验，P<0.05表示差异有统计学意义，采用Kaplan-Meier曲线及log-rank检验分析HMMR表达与肝癌患者预后间的关系。

2 结果

2.1HMMR基因在原发性肝癌患者中高表达将107例肝癌患者，包括70例肝癌组织和37例癌旁组织的临床信息及mRNA基因表达信息进行生物信息学分析，根据筛选规则(P<0.05,差异倍数>2)得到肝癌组织中相比较于癌旁组织差异表达的基因，见表1、2；对表达差异最明显的前10个基因在肝癌发生发展中的功能进行在线检索，发现HMMR在肝癌中的作用研究较少。

表1 肝癌/癌旁组织表达上调的基因

注：只显示差异最大的10个基因。

表2 肝癌/癌旁组织表达下调的基因

注：只显示差异最大的10个基因。

2.2HMMR促进肝癌细胞的增殖临床大数据分析表明HMMR在原发性肝癌患者中表达明显增高。对THPA数据库中HMMR在原发性肝癌及癌旁组织中的组织化学染色，包括8例原发性肝癌患者和6例癌旁组织进行打分，结果表明HMMR在原发性肝癌组织中的表达(IHC打分：1.39分)明显高于癌旁组织(IHC打分：0.48分)，差异有统计学意义(t=2.953,P=0.012 1),见图1。

注：A、B为肝癌组织；C、D为癌旁组织。

图1 HMMR在原发性肝癌组织中相对于癌旁组织的表达

为了进一步明确HMMR在原发性肝癌中的生物学功能。利用小干扰RNA将肝癌细胞系HepG2中的HMMR基因表达沉默，分别在蛋白水平和mRNA水平检测其敲低效率。Western Blot实验表明，沉默序列1与序列2均能有效敲低HMMR在HepG2细胞中的表达见图2；实时荧光定量PCR结果(对照：1，敲低1:0.12，敲低2:0.43)与Western Blot结果一致(对照：1，敲低1:0.08，敲低2:0.19)，差异有统计学意义(t=13.2,P=0.000 2;t=8.668,P=0.001 0)。

图2 蛋白免疫印迹实验验证HepG2中HMMR敲低效率

除此之外，平板克隆增殖实验表明敲低HMMR表达的HepG2细胞的增殖能力明显减弱(图3)；为了对该结果做进一步量化，分别在第3天和第5天将细胞消化下来进行细胞计数。通过统计分析发现，在第5天时，敲低HMMR基因表达的HepG2细胞数量(敲低1:1.5×106，敲低2:1.0×106)明显低于对照细胞(4.5×106)，差异有统计学意义(t=22.3,P=0.004 3；t=16.63,P=8×10-5)。

注：A表示对照；B表示敲低1；C表示敲低2。

图3平板克隆实验验证HMMR促进HepG2增殖

2.3肝癌组织中高表达的HMMR与患者预后的关系 Kaplan-Meier Plotter数据集(http://kmplot.com/analysis)分析了364例肝癌患者的mRNA表达以及预后信息[7]，利用该数据集分析了HMMR在肝癌患者中的预后信息。结果表明高表达HMMR的128例肝癌患者的OS明显差于低表达HMMR的236例肝癌患者[风险比(HR)=2.29(1.62～3.24),P=1.3×10-6)],见图4A；除此之外，高表达HMMR的110例肝癌患者的RFS同样比低表达HMMR的206例肝癌患者差[HR=1.99(1.42～2.78),P=3.5×10-5]，见图4B。

通过分析性别在不同表达HMMR的肝癌患者中对预后的影响，发现不同性别对不同表达HMMR的肝癌患者的预后生存率比较,差异无统计意义(P>0.05)。男性OS高表达HMMR:86例，低表达HMMR:160例，HR=2.53(1.63～3.94),P=2.1×10-5;女性OS高表达HMMR:40例，低表达HMMR:78例，HR=2.2(1.25～3.85)，P=0.004 8；男性RFS高表达HMMR:75例，低表达HMMR:135例，HR=2.1(1.40～3.14)，P=2.2×10-4；女性RFS高表达HMMR:28例，低表达HMMR:78例，HR=1.91(1.02～3.58)，P=0.040 0，见图5，该结果表明高表达HMMR的男性和女性的肝癌患者的预后明显差于低表达HMMR的肝癌患者。

注：A 表示肝癌患者中HMMR表达越高OS越差；B 表示肝癌患者中HMMR表达越高，RFS生存率越差。

图4 HMMR高表达与肝癌患者不良预后有关

注：A 表示肝癌男性患者中HMMR表达与OS的相关性；B 表示肝癌女性患者中HMMR表达与OS的相关性；C 表示肝癌男性患者中HMMR表达与RFS的相关性；D 表示肝癌女性患者中HMMR表达与RFS的相关性。

图5 HMMR高表达与肝癌患者预后的关系与性别的关系

2.4HMMR在早期肝癌患者的临床预后预测中具有潜在应用价值将肝癌患者根据肿瘤分期分为3组(1期与2期、2期与3期、3期与4期)，通过分析不同分期肝癌患者中HMMR的表达高低对患者预后的影响，研究发现早期肝癌患者(1+2期)中高表达HMMR的肝癌患者(n=94)OS的预后明显差于低表达HMMR的肝癌患者(n=174)[HR=2.74(1.68～4.47),P=2.4×10-5]，随着肝癌患者肿瘤分期的增加(3+4期)，该差异逐渐变小[HR=2.77(1.23～6.25),P=0.011 0],见图6。RFS高肿瘤分期的肝癌患者(3+4期)中，高表达HMMR的肝癌患者(n=40)与低表达HMMR的肝癌患者(n=30)的RFS比较，差异无统计学意义[HR=1.79(0.95～3.37),P=0.070 0]，见图6。该结果表明，HMMR能够预测早期肝癌患者的临床预后，对早期肝癌患者的后续治疗与监测具有重要意义。

注：A表示 HMMR表达与肝癌肿瘤分期(1+2期)对肝癌患者OS的影响；B表示 HMMR表达与肝癌肿瘤分期(2+3期)对肝癌患者OS的影响；C表示 HMMR表达与肝癌肿瘤分期(3+4期)对肝癌患者OS的影响；D表示HMMR表达与肝癌肿瘤分期(1+2期)对肝癌患者RFS的影响；E 表示HMMR表达与肝癌肿瘤分期(2+3期)对肝癌患者RFS的影响；F表示 HMMR表达与肝癌肿瘤分期(3+4期)对肝癌患者RFS的影响。

图6 HMMR在早期肝癌患者的临床预后预测中具有潜在应用价值

3 讨论

肝癌病情发展迅速，近年来其发生率和病死率不断攀升。由于缺乏有效的早期诊断标志物和治疗靶点，许多患者往往不能早期发现和有效治疗，2/3的肝癌患者确诊时已处于中晚期[8]。目前大部分肝癌研究都集中在中晚期阶段，而对肝癌早期的情况知之甚少。因此，寻找肝癌早期特异性的诊断标志物和治疗靶点显得十分迫切。

HMMR在多种肿瘤的发生发展中具有重要作用。HMMR在胶质母细胞瘤的发生发展中高表达，能够促进胶质干细胞的自我更新和肿瘤生长，在胶质母细胞瘤中发挥重要作用，有望作为潜在的治疗靶点[9]。除此之外，大数据分析结果表明该分子在乳腺癌中能够发生单核苷酸位点的突变，该分子的突变位点的检测可作为乳腺癌诊断的新型分子标志物[10]。HMMR除了在肿瘤的发生发展中具有重要作用，其在细胞转移中同样具有重要作用，尤其参与心脏再生过程[11]。HMMR在PLK1介导的细胞周期中具有重要作用，促进神经阻滞发育[12]。有意思的是，调控HMMR的lncRNA在神经胶质细胞瘤中能够减弱HMMR表达，抑制细胞迁移和侵袭能力，同样为神经胶质瘤的治疗提供了潜在靶点[13]。尽管HMMR在多种肿瘤发生发展及细胞侵袭中具有重要作用，但是，HMMR在肝癌中的作用研究较少。尽管在该文章中发现HMMR能够促进肝癌细胞增殖且与早期预后相关，但是具体调控HMMR的分子机制未知，相关机制的研究正是今后探索的一个方向。

目前，肝癌筛查的肿瘤标志物层出不穷，从最经典的甲胎蛋白(AFP)到现在走向临床的甲胎蛋白异质体(AFP-L3)和异常凝血酶原(PIVKA-Ⅱ)，均表现出了其在临床应用中的价值。研究表明，目前临床所使用的肝癌筛查及监测的肿瘤标志物只在某种类型肿瘤或者条件下适用，并不能筛查出所有的肝癌患者，尽管该文中从分子生物学及临床预后方面阐明了HMMR有望作为肝癌早期诊断和预后判断的分子标志物，但是HMMR与现有标志物如AFP、AFP-L3、PIVKA -Ⅱ比较并没有涉及，是否有协同作用或互补作用，这都是后续研究的一个重要方向。