miR-34和IMP3在卵巢癌组织中的表达及临床意义

2020-04-20叶芳丽将翡翎潘在兴魏小斌吴翔宇

国际检验医学杂志 2020年7期

叶芳丽，将翡翎，潘在兴，魏小斌，吴翔宇

(海口市人民医院检验科，海南海口 570208)

卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤之一，其以进展快及患者预后差为主要特点，由于患病初期症状不明显导致大部分患者确诊时已处于癌症晚期，严重危及女性健康[1]。目前临床常采用手术并辅以放化疗治疗卵巢癌，但其副作用较大且严重降低术后患者生活质量，因而探寻早期诊断卵巢癌的特异性标志物对提高治疗效果及改善患者预后具有重要意义。微小RNA(miRNA)作为一类内源性非编码RNA分子，研究证实miRNAs与多种恶性肿瘤发生过程密切相关并可作为多种恶性肿瘤治疗的靶标基因[2]。微小RNA34(miR-34)是一种与肿瘤细胞增殖、凋亡有关的重要基因并可调节多种基因表达[3]。研究显示胰岛素样生长因子ⅡmRNA结合蛋白3(IMP3)可通过与胰岛素样生长因子相互作用进而参与多种肿瘤细胞增殖过程[4]。通过Gene Cards网站预测IMP3为miR-34的靶基因，关于miR-34与IMP3在卵巢癌中的表达研究尚未见报道，因此本研究主要探讨卵巢癌组织中miR-34与IMP3表达变化，分析其与患者临床参数及预后的关系，为临床早期诊断及治疗卵巢癌提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2016年2月至2018年12月本院收治的92例卵巢癌患者的手术中切除的癌组织标本为卵巢癌组，另选取距癌组织边缘大于5 cm的相应癌旁组织标本为对照组，所有患者均经病理证实为卵巢癌，将卵巢癌组织及癌旁组织标本冻存于-80 ℃超低温冰箱。年龄45～71岁，平均(52.51±7.15)岁，收集卵巢癌患者临床病理资料，包括肿瘤大小、病理类型、病理分级、淋巴结转移、临床分期、分化程度、腹腔积液转移等。按照世界卫生组织将卵巢癌患者病理类型进行分类，其中浆液性癌 23例，黏液性癌 32例，内膜样癌 37例[5]。临床分期为Ⅰ期 16例、Ⅱ期 25例、Ⅲ期 51例[6]。分化程度：高分化 23例、中分化 41例、低分化 28例；腹腔积液转移患者53例，未转移患者39例。纳入标准：(1)卵巢癌患者均经手术病理证实；(2)术前未接受化疗、放疗者；(3)癌旁组织经病理证实无癌细胞浸润者；(4)患者知情且签署同意书。排除标准：(1)自身免疫性疾病者；(2)肝肾功能严重损伤患者；(3)合并其他恶性肿瘤者；(4)临床资料不完整者；(5)心力衰竭及原发性高血压患者。

1.2方法

1.2.1实时荧光定量(qPCR)检测卵巢癌组织中miR-34与IMP3 mRNA相对表达量采用qPCR法检测卵巢癌组织中miR-34与IMP3 mRNA相对表达量。取出冻存卵巢癌组织及癌旁组织标本。(1)提取总RNA：按照Trizol试剂盒说明书操作；(2)反转录：将2 μg RNA反转录为cDNA(RNA反转录试剂盒)；(3)配qPCR反应体系：按照SYBR Green RCR master mix试剂说明配反应体系(20 μL)，其中SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL，cDNA 2.0 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL，ddH2O 6.0 μL。将其置于荧光定量PCR仪上进行反应，程序设定为：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共40个循环。miR-34以U6为内参基因，IMP3以β-actin为内参基因，引物设计见表1。反应结束后对所得数据循环阈值(Ct值)进行分析，采用2-ΔΔCt算法计算miR-34与IMP3 mRNA的相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.2免疫组化法检测卵巢癌组织中IMP3蛋白表达将卵巢癌组织标本制作为石蜡切片并连续切片(厚度为4 μm)，二甲苯脱蜡与不同浓度乙醇脱水后进行热抗原修复，过氧化氢(3%)灭活后采用山羊血封闭，具体步骤均严格按照SP试剂盒说明书操作，其中IMP3抗体稀释比为1∶100(美国Abnova公司)，DAB(北京中杉金桥生物技术有限公司)显色，苏木素复染并将其在不同浓度乙醇中脱水，中性树脂进行封片，置于显微镜下观察。结果判定：从每个切片中选取5～10个高倍视野并统计阳性染色细胞数量[7]。(1)染色程度记分：无色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；(2)阳性细胞数评分：阳性细胞百分比≤10% 为1分，10%～50% 为2分，50%～75%为 3分，>75% 为4分。取两组计分之乘积：≤3分为阴性，>3分为阳性。

1.3随访通过打电话访问、门诊复查等方式对所有卵巢癌患者进行随访，随访3年后绘制Kaplan-Meier曲线并统计无生存进展期(PFS)与总体生存时间(OS)。

2 结果

2.1两组miR-34与IMP3 mRNA表达水平比较与对照组相比，卵巢癌组患者miR-34表达水平显著降低，而IMP3 mRNA表达水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组miR-34与IMP3 mRNA表达水平比较

2.2卵巢癌组织中IMP3蛋白表达结果免疫组化显示IMP3定位于肿瘤细胞细胞质，染色呈黄色、棕黄色、棕褐色，见图1。与对照组相比，卵巢癌组IMP3蛋白阳性表达率显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

注：A为阴性表达，B为阳性表达。

图1卵巢癌组织中IMP3蛋白表达情况(×400)

表3 卵巢癌组织中IMP3蛋白表达结果

表4 miR-34、IMP3表达与卵巢癌患者临床病理参数的关系[n(%)]

续表4 miR-34、IMP3表达与卵巢癌患者临床病理参数的关系[n(%)]

2.4卵巢癌患者miR-34与IMP3表达的相关性 Pearson法分析卵巢癌患者miR-34与IMP3表达的关系，结果显示miR-34与IMP3呈显著负相关(r=-0.608，P=0.000)，见图2。

图2 卵巢癌患者miR-34与IMP3表达的相关性分析

2.5miR-34、IMP3表达与卵巢癌患者预后的关系 Kaplan-Meier法分析miR-34、IMP3表达与卵巢癌患者预后(PFS、OS)的关系，结果显示与miR-34低表达组PFS(20.03%)、OS(21.02%)相比，miR-34高表达组PFS(41.20%)、OS(42.21%)均显著升高(P<0.05)；与IMP3阴性表达组PFS(45.13%)、OS(52.17%)相比，IMP3阳性表达组PFS(30.03%)、OS(26.15%)均显著降低(P<0.05)，见图3、4。

注：A为PFS曲线，B为OS曲线。

图3卵巢癌患者miR-34表达与PFS、OS的关系

注：A为PFS曲线，B为OS曲线。

图4卵巢癌患者IMP3表达与PFS、OS的关系

3 讨论

卵巢癌患者病死率极高，其发病机制尚未完全阐明，同时由于缺乏早期诊断卵巢癌的特异性标志物导致诊断及治疗效果不佳[8]。研究显示miRNAs可通过调控下游靶基因的表达进而参与卵巢癌发生及其肿瘤细胞增殖、迁移过程[9]。近来研究报道指出，部分miRNAs可用于早期诊断与评估癌症患者预后的重要标志物，同时也可作为肿瘤治疗靶点[10]。因此，本研究主要分析miR-34及其预测靶基因IMP3在卵巢癌发生发展过程中的表达及其临床意义，旨在为临床早期诊疗卵巢癌及改善患者预后提供科学依据。

miR-34的基因序列具有高度保守性，研究显示miR-34又可分为miR-34a、miR-34b并可作为抑癌基因通过调控细胞周期进而诱导细胞凋亡[11]。研究证实miR-34在结肠癌组织中明显下调并与TNM分期及淋巴结转移紧密相关[12]。食管鳞状细胞癌组织中miR-34过表达时可抑制肿瘤细胞生长[13]。P53可激活miR-34并促使其发挥其抑癌基因功能，同时miR-34可修复p53基因功能进而促进细胞增殖[14]。P53/miR-34a通路激活后可抑制肿瘤细胞增殖及分化并为治疗方案提供理论支撑[15]。miR-34在卵巢癌中的作用研究尚未见报道，本研究通过qPCR检测miR-34在卵巢癌组织中的表达，结果显示卵巢癌组miR-34表达水平显著低于对照组，说明卵巢癌组织中miR-34呈低表达，并可能参与卵巢癌的发生过程。卵巢癌患者临床病理参数显示卵巢癌组织中高分化miR-34表达显著低于中/低分化；病理分级G1期miR-34表达显著低于G2、G3期；临床分期Ⅰ、Ⅱ期患者miR-34表达显著低于Ⅲ期患者；淋巴结转移与腹腔积液转移患者miR-34表达显著高于无淋巴结转移及无腹腔积液转移患者，提示miR-34表达与卵巢癌患者疾病进展有关，可能参与卵巢癌发展过程。

癌胚蛋白IMP3具有促进肿瘤细胞增殖及分化的功能，并与胃癌患者疾病进展及预后有关[16]。研究显示IMP3主要通过调控胰岛素样生长因子Ⅱ表达进而促进肿瘤细胞增殖，其在多种癌组织中呈高表达并可作为宫颈癌的标志物[17]。IMP3与P53共同作用可激活P53/Cyc信号通路进而提高癌细胞DNA增殖活性，同时可加快癌细胞早期分化调控因子的转录过程导致癌症发生[18]。本研究结果显示卵巢癌组IMP3 mRNA表达水平显著高于对照组，免疫组化结果显示卵巢癌组织中IMP3蛋白阳性表达率显著高于对照组，说明IMP3在卵巢癌组织中呈高表达。进一步观察其与卵巢癌患者临床病理参数的关系，结果显示高临床分期、高病理分级、低分化、淋巴结转移及腹腔积液转移的卵巢癌组织中IMP3蛋白阳性表达率显著升高，提示IMP3蛋白表达与卵巢癌恶性程度有关并可参与肿瘤发生及发展过程。卵巢癌患者预后较差且生存率极低，本研究采用Kaplan-Meier法分析miR-34、IMP3表达与卵巢癌患者预后的关系，结果显示miR-34低表达、IMP3阳性表达患者生存期显著降低，说明miR-34、IMP3表达与患者预后密切相关。同时本研究结果显示miR-34与IMP3表达呈显著负相关(r=-0.608，P=0.000)，分析其原因可能为miR-34低表达促使预测靶基因IMP3表达水平升高，IMP3与P53相互作用进而促使癌细胞增殖及分化导致病情恶化。本研究结果提示miR-34与IMP3可能参与卵巢癌发生及发展过程，并与卵巢癌患者预后密切相关。