P16、Ki-67蛋白表达及HPV检测在宫颈上皮内瘤变中的意义*

张 坤，刘 慧，白 石

(1.徐州医科大学，江苏徐州 221002；2.宿迁市钟吾医院病理科，江苏宿迁 223800)

宫颈上皮内瘤变(CIN)是妇科临床上的一种最为常见的病症之一，是与子宫颈癌有紧密联系的一组癌前病变的统称[1]。CIN反映的是一段宫颈癌前病变的连续过程，即由最初的宫颈不典型增生最终发展为浸润性宫颈癌的一系列病理变化，由于其癌前病变过程较长，根据世界卫生组织(WHO)的分类标准，可将CIN分为CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ3个等级[2]。其中，CINⅠ为轻度病变，约65%的患者可自行恢复，CINⅡ和CINⅢ为高度上皮内瘤样病变，需对患者采取有效的治疗措施。近年来，宫颈癌在妇科临床上呈高发态势，已成为导致女性死亡的第二大恶性肿瘤，所以对宫颈癌患者需及早诊断并加以治疗，但由于CIN的临床特征不明显，对CIN的鉴别诊断存在一定的困难。因此，探究一种CIN的早期诊断方法显得尤为迫切。现有研究表明，P16是一种抑癌基因，细胞内的P16蛋白直接参与细胞周期的调节，P16蛋白的减少会导致细胞无限制增生，进而引发癌变[3]；Ki-67是一种肿瘤增殖抗原，是判断癌细胞增殖情况的一个重要指标[4-6]，二者的表达情况对肿瘤细胞的判定具有重要意义。近年随着流行病学和分子生物学研究的不断深入，人们发现人乳头瘤病毒(HPV)具有致癌性[7]，并且HPV的感染与CIN的发生有着紧密的联系。本研究旨在通过联合检测P16、Ki-67蛋白的表达及HPV的感染情况，进而找到其与CIN的联系，为临床上CIN的诊断提供新的依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年1月至2018年2月来宿迁市钟吾医院进行宫颈组织活检或宫颈LEEP术的患者160例作为研究对象。其中120例出现CIN患者作为观察组。观察组CINⅠ级36例，CINⅡ级43例，CINⅢ级41例。年龄26～61岁，平均(42.61±1.56)岁。纳入标准：(1)依据国际妇产科联盟(FIGO)的诊断标准[8]，经阴道镜检查和宫颈组织活检确定为CIN的患者；(2)非HIV感染者，且患者无子宫内膜病变史；(3)遵守医学实验伦理学原则，经与患者和家属沟通，其自愿签订知情同意书。排除标准：(1)妊娠期或哺乳期内的患者；(2)就诊前半个月内发生过感染性疾病；(3)合并有器官衰竭，肝、肾疾病和其他肿瘤疾病史；(4)宫颈组织活检前进行过化疗或者放疗的患者。对照组为40例正常宫颈黏膜上皮组织的患者，平均(43.25±1.25)岁，无肝、肾疾病，无肿瘤史。对照组与观察组在年龄等方面比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2仪器与试剂 即用型P16鼠单克隆抗体和即用型Ki-67鼠单克隆抗体购自赛默飞世尔科技有限公司，SP广谱超敏试剂盒、PBS液和DAB过氧化物酶显色底物剂等购自北京中杉生物科技有限公司，HPV-DNA检测试剂盒、基因杂交信号放大仪和自动恒温加热器等购自凯杰企业管理(上海)有限公司。

1.3方法

1.3.1免疫组化法检测P16和Ki-67 实验中所用标本先由10%的甲醛溶液固定，用HE染色经显微镜观察后严格挑选得出。采用免疫组化SP法，具体操作严格按照试剂盒的使用说明书的步骤进行。结果判断根据切片中阳性细胞的染色情况，P16阳性细胞为细胞核或细胞质出现棕黄色颗粒，Ki-67阳性细胞为细胞核出现棕黄色颗粒。在高倍镜下于染色区域随机选择5个视野，共计数500个肿瘤细胞，分别计算P16和Ki-67细胞阳性率。判断标准：细胞阳性率小于5%为阴性(-),5%～<25%为弱阳性(+)，25%～<50%为中等阳性(++)，≥50%为强阳性(+++)。

1.3.2HPV检测 采用Digene公司推出的第二代杂交捕获实验(HC2)测定HPV-DNA水平，详细操作严格按照仪器和试剂盒的使用说明书的步骤执行。检测结果依据HPV-DNA水平分为阳性和阴性，其中HPV-DNA≥1.0 pg/mL为阳性(+)，HPV-DNA<1.0 pg/mL为阴性(-)。

2 结 果

2.1P16和Ki-67的表达情况及相关性 对照组P16、Ki-67阳性率分别为7.50%(3/40)、15.00%(6/40)；观察组P16、Ki-67的总阳性率分别为85.00%(102/120)、92.50%(111/120)，观察组P16、Ki-67阳性率明显高于对照组，两组之间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。从观察组内来看，CINⅠ患者P16阴性表达最多，P16阳性表达中主要是以弱阳性为主，Ki-67的表达则是弱阳性最多；而CINⅡ和CINⅢ患者P16、Ki-67的表达绝大部分都是阳性，且强阳性的表达例数最多。据此可分析得出：P16与Ki-67在CIN中的表达与CIN的分级呈正相关(r=1.000,P<0.05)，且P16和Ki-67的强阳性表达提示着高度宫颈上皮内瘤变。进一步分析发现，CINⅠ患者P16、Ki-67阳性率,明显低于CINⅡ和CINⅢ患者，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1、2。

表1 两组中P16表达情况比较

P16和Ki-67在高度宫颈上皮内瘤变的表达情况见表3。可以看出，在高度宫颈上皮内瘤变的患者中，P16和Ki-67都表达为阳性的数量最多，且二者均表达为阴性的情况不存在，提示P16和Ki-67的高表达与高度宫颈上皮内瘤变有关。将P16和Ki-67的阴性表达记为0，弱阳性表达记为1，中等阳性表达记为2，强阳性表达记为3，经统计学软件分析后得出以下结论：在本研究中，对照组和CINⅠ患者的P16、Ki-67表达不具有相关性。在高度宫颈上皮内瘤变中(CINⅡ和CINⅢ)，P16和Ki-67的表达呈正相关(r=0.785，P<0.05)

表2 两组中Ki-67表达情况比较

表3 高度宫颈上皮内瘤变中P16和Ki-67的表达情况

2.2HPV检测情况 观察组HPV总阳性率为81.67%(98/120)，而对照组HPV阳性率仅有12.50%(5/40)，观察组阳性率明显高于对照组，两组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。从观察组来看，CINⅠ患者HPV阴性的例数有13例，随着CIN病变级别的升高，HPV阴性的例数骤降至6例和3例，HPV阳性率随之逐渐升高，将高度宫颈上皮内瘤变与低度宫颈上皮内瘤变中HPV阳性率对比，发现二者的差异具有统计学意义(P<0.05)，见表4。经Spearman法分析后还发现，在观察组中HPV阳性率与P16蛋白的表达情况呈正相关(r=0.486，P<0.05)。

表4 HPV-DNA的表达情况

3 讨 论

子宫颈癌目前在我国已成为危害妇女健康的第二大恶性肿瘤，但现代医疗技术对其发生率的影响有限，所以目前子宫颈癌的防治有赖于对其进行行之有效的人群筛查[8]。CIN反映的是一段浸润性宫颈癌的癌前病变过程，CIN与宫颈癌的发生有着极其密切的关系，因此CIN的准确诊断对妇科临床尤其是宫颈癌的防治有着重要的意义。但由于CIN的临床特征不明显，所以仅凭临床症状来诊断CIN十分困难。近年来的研究表明，P16和Ki-67的表达与肿瘤细胞的增殖息息相关，且HPV的感染是导致CIN的重要因素。

P16基因是一种抑癌基因，其编码的产物P16蛋白直接作用于细胞周期。P16蛋白可抑制细胞周期依赖酶CDK4的活性，从而阻止细胞从G1期进入S期，进而抑制细胞增殖。若P16基因突变或缺失，则CDK4的活性增强，进而引起细胞分裂加速，最终导致细胞恶性增殖[9-10]。在本研究中，观察组的P16阳性率(85.00%)，明显高于对照组阳性率(7.50%)，差异有统计学意义(P<0.05)，而且在观察组中CINⅡ和CINⅢ患者P16阳性率明显高于CINⅠ患者，差异具有统计学意义(P<0.05)。推测P16与CIN有着紧密的联系，P16的阳性表达可视为CIN发生的危险因素，且P16的阳性率随CIN病变程度的加深而增高。Ki-67是一种位于细胞核内的非组蛋白，其作用于细胞分裂的G1、S、G2、M期[11-12]，Ki-67在细胞中表达越高，表明细胞增殖越快，细胞分化越差[13]，研究已证实Ki-67可作为判断肿瘤细胞增殖能力的标记物。在本研究中，观察组Ki-67的阳性率，明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，推测Ki-67的阳性表达是CIN发生的标志之一。从观察组来看，轻度宫颈上皮内瘤变患者的Ki-67阳性率较低，且强阳性和中等阳性的表达例数较少；而高度宫颈上皮内瘤变患者Ki-67阳性率较高，且强阳性和中等阳性的例数较CINⅠ型有明显的增多，可推知Ki-67的表达水平随CIN的发展而增强。经相关性分析得知在高度上皮内瘤变中P16与Ki-67的表达呈正相关(r=0.785,P<0.05)，在低度宫颈上皮内瘤变中不相关，相关研究表明这是由于二者在细胞增殖的不同阶段表达的情况不同[13]，据此推测P16和Ki-67蛋白表达的差异还可以作为CIN病变程度的区分标准，而且两种蛋白在高度宫颈上皮内瘤变中的表达水平存在一定的联系。所以，联合检测P16与Ki-67的表达情况有助于提高CIN诊断的准确率。

HPV是一种环状双链结构的病毒，目前已有研究证实HPV感染是引发宫颈癌的最主要因素[14-16]，本研究中，观察组与对照组HPV阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05)，表明HPV的感染是诱发CIN的因素，进一步分析发现在观察组内HPV的阳性率随CIN的发展而升高，推测HPV的感染推进宫颈病变的加重。研究中还发现，HPV阳性率与P16蛋白的表达呈正相关(r=0.486,P<0.05)，说明P16的表达与HPV的感染有关，且HPV的感染推动着P16蛋白的高表达，临床上对CIN的诊断及预后可将HPV的阳性率作为重要指标。

综上所述，本研究通过检测P16、Ki-67蛋白的表达情况来说明了二者的阳性表达与CIN的密切关系，进一步证实了两种蛋白在高度宫颈上皮内瘤变中的相关性，但未能具体说明低度宫颈上皮内瘤变中P16、Ki-67蛋白表达情况不相关的原因。实验还通过对HPV-DNA的检测来说明了HPV的感染是诱发CIN的重要原因，并发现HPV的感染推动着P16蛋白的表达，但HPV与P16蛋白二者存在相关性的证据还需进一步探究。与以往的研究相比，此次研究不仅证实了P16、Ki-67蛋白表达情况的差异与CIN的病变程度的关系，还进一步探究了HPV在CIN中的作用机制，为临床上CIN的检测与分型提供了新的理论依据。

4 结 论

以上实验表明，HPV的感染是诱发CIN的重要因素，P16和Ki-67的阳性表达可作为判断CIN发生的提示因素，且在高度宫颈上皮内瘤变中P16与Ki-67的表达呈正相关。通过联合检测HPV-DNA、P16和Ki-67的表达情况可作为判断CIN的发生的新依据。本研究证实了联合检测P16、Ki-67及HPV的表达不仅能提高CIN诊断的准确率，并能进一步鉴别CIN的病变程度，对CIN的临床诊断及筛查有重要价值。