脆性卵膜卵母细胞卵胞浆内单精子注射的胚胎发育与临床结局分析

戴旭，师娟子，薛侠，李伟，施文浩

(西安医学院，西北妇女儿童医院，西安 710003)

卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)是通过显微操作技术直接将精子注射到卵胞浆内，这项技术解决了许多因男方因素所导致的不育症，在辅助生殖领域取得了极其广泛的应用[1]。正常情况下，在ICSI针刺入卵膜时卵胞膜有一定弹性，有破膜感。但临床实际工作中发现部分卵胞膜表现为没有弹性，这种ICSI针无阻力感直接破膜的卵胞膜定义为脆性卵膜。既往文献报道脆性卵膜卵母细胞ICSI后受精能力下降，卵细胞退化率升高[2]，但临床妊娠结局很少有报道。本研究主要探讨在辅助生殖技术ICSI治疗中出现脆性卵膜卵母细胞的临床妊娠结局，分析其中可能的原因，为脆性卵膜提供可能的预防和治疗措施。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2015年1月至2019年3月西北妇女儿童医院生殖中心的ICSI治疗周期。排除供卵、供精、胚胎植入前遗传学检测(PGT)周期的患者。精子注射时卵细胞膜表现为没有弹性，ICSI针无阻力感直接破膜即为脆性卵膜组，共196 个周期。通过倾向值匹配(匹配容差为0.05)进行1∶2的匹配，产生对照组(无脆性破膜卵母细胞)共392 个周期纳入本研究，匹配变量包括患者年龄、BMI、不孕因素、用药方案。

二、研究方法

1.促排卵方案及卵细胞的获取：根据患者的具体情况选择常规长方案、超长方案、短方案、拮抗剂、微刺激等方案促排卵，动态监测卵泡发育以及血清性激素水平，当直径≥18 mm的卵泡≥2枚，或≥17 mm的卵泡≥3枚时，注射HCG(珠海丽珠医药)5 000～10 000 U，注射后36 h后经阴道超声引导下取卵。

2.精子准备：患者取精前禁欲2～7 d，取卵当天采用手淫方式留取精液，然后采用密度梯度离心法处理精液，选择活动精子行ICSI。

3.卵母细胞准备：将卵冠丘复合物(OCCCs)置于透明质酸酶(Irvine Scientific，美国)中，轻柔吹吸消化颗粒细胞，时间控制在60 s以内。然后将卵母细胞转移至G-IVF PLUS(Vitrolife，瑞典)，用内径140 μm的脱颗粒针(COOK，美国)剥去颗粒细胞。

4.ICSI授精：将卵母细胞和精子分别加入到盖有矿物油(Vitrolife，瑞典)的G-MOPS PLUS(Vitrolife，瑞典)操作微滴中，应用显微操作系统(Nikon，日本)进行ICSI操作。用固定针(Sunlight，美国)固定卵子，使第一极体位于约12点的位置。用注射针(Sunlight，美国)选择形态正常、活力好的精子在聚乙烯吡咯烷酮(Vitrolife，瑞典)中制动，然后注射针从3点钟方向进针将精子注入卵母细胞。正常情况下穿刺针头部过中线位置后缓慢回吸收胞浆至突然加速，提示卵细胞破膜。停止回吸收，将精子慢慢注入胞质后，稍作停顿再缓慢退出注射针。而在脆性卵膜卵母细胞的注射过程中，卵细胞膜没有弹性，ICSI针直接进入卵胞质内，将精子注入后未回吸胞质直接退针。将注射后的卵母细胞转移至G-1 PLUS(Vitrolife，瑞典)微滴中培养。

5.胚胎培养和移植：授精后16～20 h，观察是否出现原核(PN)及原核数，见到两个原核(2PN)确定为正常受精。授精后第3天观察胚胎发育情况并进行评分，评分方法参考我中心之前发表的文献[3]。评分为Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级胚胎为可用胚胎，Ⅰ级和Ⅱ级为优质胚胎。若有2 枚及以上优质胚胎时建议进行囊胚培养，将胚胎转移至G-2 PLUS(Vitrolife，瑞典)微滴培养，并根据Gardner方法[4]对囊胚评分。在第3天或第5天选择1～2 枚胚胎移植入子宫。移植当日开始使用黄体酮肌肉注射或阴道栓剂进行黄体支持。

6.妊娠判断：卵裂期胚胎移植后14 d测血HCG≥50 U/L、囊胚期胚胎移植后9 d测血HCG≥25 U/L确定为HCG阳性；移植后28 d经阴道超声见孕囊者定义为临床妊娠；HCG阳性而宫内外均未见孕囊者定义为生化妊娠。

7.评价指标：成熟卵母细胞率=MⅡ卵母细胞总数/获卵总数×100%；ICSI卵细胞退化率=退化卵细胞数/注射MⅡ卵母细胞总数×100%；正常受精率=正常受精卵数(2PN)/MⅡ卵子总数×100%；卵裂率=正常受精卵裂数/正常受精卵数目×100%；D3优质胚胎率=D3优质胚胎数目/正常受精卵裂胚胎总数×100%；D3可用胚胎率=D3可用胚胎数目/正常受精卵裂胚胎总数×100%；囊胚形成率=可用囊胚数/培养囊胚胚胎总数×100%；未成熟卵母细胞率=(第一次减数分裂中期卵母细胞总数+生发泡期卵母细胞总数)/获卵数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；种植率=孕囊数/移植胚胎数×100%。

三、统计学分析

利用易侕统计软件进行倾向值匹配(匹配容差为0.05，进行1∶2的匹配)，得出脆性卵膜组和对照组。采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，组间均数的比较方法采用独立样本t检验；计数资料用百分比表示，组间比较方法采用卡方检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、基本资料

脆性卵膜组和对照组两组患者在年龄、不孕年限、不孕类型、基础FSH水平、基础窦卵泡数、Gn总量、Gn总天数、HCG日激素水平(雌二醇、孕酮、促黄体生成素)、获卵数目等方面均无显著差异(P均>0.05)(表1)。

表1 两组患者基本情况的比较[(-±s)，%]

二、受精和胚胎情况

脆性卵膜组的成熟卵细胞率、正常受精率、可用胚胎率、优质胚胎率均显著低于对照组(P<0.05)，而卵细胞ICSI后发生卵细胞退化率显著高于对照组(P<0.05)；两组间卵裂率、囊胚形成率均无显著差异(P>0.05)(表2)。

为了进一步了解两组患者每周期所获卵中未成熟卵母细胞占比的差异，将未成熟卵母细胞率按照<25%，26%～50%之间和>50%进行具体分层，统计两组之间各分层周期的占比情况。结果显示，脆性卵膜组的未成熟卵母细胞率在0%～25%区间所占周期数显著低于对照组(P<0.05)，而未成熟卵母细胞率为26%～50%和>50%两个区间所占周期数显著高于对照组(P<0.05)(表3)。

三、妊娠结局

脆性卵膜组和对照组间新鲜周期移植胚胎个数、移植日子宫内膜厚度均无显著差异(P>0.05)。脆性卵膜组的胚胎种植率、临床妊娠率均低于对照组，但差异无显著性(P>0.05)(表4)。

表2 两组间获卵以及胚胎质量的比较(%)

注：与对照组比较，*P<0.05

表3 两组间未成熟卵母细胞率的比较(%)

注：与对照组比较，*P<0.05

表4 两组新鲜周期移植妊娠结局比较[(-±s)，%]

讨 论

在观察期间的4 254个ICSI治疗周期中有4.6%的ICSI周期的卵母细胞在ICSI注射时表现为脆性卵膜。脆性卵膜卵母细胞ICSI后卵细胞退化率升高，受精能力和胚胎发育潜能明显下降，但胚胎种植潜能与临床妊娠结局与正常卵膜组相比虽略有下降，但无显著差异(P>0.05)。本研究发现脆性卵膜组患者同一周期促排卵所获卵细胞中，未成熟卵母细胞数居多，推测脆性卵膜卵母细胞的存在可能与卵细胞的质量以及成熟度相关。卵细胞的质量与其生长的卵泡微环境关系密切，不同的卵泡可能有不同的血供和激素水平。因此，同一促排周期获得的卵细胞会表现出不同的形态特征，包括卵膜的特性[5-6]。Palermo等[7]研究发现脆性卵膜组患者促性腺激素使用天数短于正常卵膜组，扳机日雌激素水平也低于正常卵膜组，并考虑脆性卵膜与构成细胞膜的脂蛋白结构异常相关，而这种异常可能是由控制性促排卵期间卵泡激素环境改变引起的。Rosen等[5]的研究发现ICSI后卵细胞退化率高的患者基础雌激素和扳机日雌激素水平都较低。但也有文献报道HCG日高的雌激素水平可能会增加脆性卵膜卵母细胞出现的概率[2]。在本研究中，脆性卵膜卵母细胞组与对照组患者无论是在基础FSH水平还是扳机日激素水平都没有明显差异。所以脆性卵膜卵母细胞可能受多种因素的影响，激素影响也许只是其中的一部分因素，具体机制还需要进一步的研究。

受精前成熟卵母细胞停滞在第二次减数分裂中期(MⅡ)，卵母细胞的胞质和细胞核同步发育成熟，才具有良好的受精和胚胎发育潜能。ICSI注射前通过剥除颗粒细胞后观察卵母细胞的第一极体排出情况判断卵母细胞的成熟度，并以MⅡ卵率作为评估卵细胞成熟度指标之一，用于预测ICSI受精率和胚胎发育潜能[8-9]。有研究表明卵细胞的成熟度不足会抑制皮质颗粒的释放，导致透明带硬化并影响之后的受精过程[10]。Halvaei等[6]的数据显示在每个取卵周期中仍有15%的卵细胞处于未成熟的状态，且未成熟卵细胞的数量对受精结局具有预测作用，当未成熟卵母细胞数≥2个时，受精率明显下降。本研究中脆性卵膜细胞组的未成熟卵母细胞率显著高于对照组且受精率显著低于对照组的结果与之相似。Parrella等[11]的研究数据显示ICSI周期未成熟卵母细胞率升高，卵子退化率会增加，受精能力和胚胎发育潜能下降。而本研究中脆性卵膜组卵母细胞ICSI后退化率也显著升高，提示卵母细胞成熟度与卵膜的脆性可能相关。

ICSI是一种侵袭性操作，ICSI针机械地穿过卵母细胞的透明带与细胞膜可能会破坏线粒体、微管、纺锤体等细胞器的分布，甚至损伤细胞内重要细胞器。正常的卵细胞膜具有一定的张力，注射针穿刺到卵细胞膜时会形成一个漏斗状的形态，轻微回吸收少许胞质卵膜即穿破，退针过程中卵细胞膜缓慢恢复正常形态，确保了细胞膜的完整性，避免了微管、线粒体等细胞器的损伤。在小鼠卵母细胞注射实验中已证实了卵膜凹陷成漏斗状，对于卵细胞具有保护作用，可避免卵细胞在注射后发生退化[12]。在本研究中，脆性卵膜细胞组ICSI后卵细胞退化率高于对照组，受精率低于对照组，这个结果与之前的研究一致[2，13]。这可能是因为ICSI针直接穿破卵细胞膜，脆性卵膜卵母细胞缺乏漏斗状的保护作用，从而破坏了细胞骨架的完整性，最终导致卵细胞发生退化[2，7]。

在本研究中，脆性卵膜组与对照组在囊胚形成率、种植率、临床妊娠率等方面均无显著性差异(P>0.05)。提示我们尽管脆性卵膜卵母细胞ICSI后容易发生退化，但如果脆性卵膜卵母细胞能够正常受精，则与正常卵母细胞有着相同的种植潜能。Mizobe等[2]研究也发现脆性卵膜卵母细胞来源的胚胎与正常卵母细胞来源的胚胎有相同的种植潜能，而且同一患者促排卵所收获的同胞卵中既有正常的卵母细胞又有脆性卵膜卵母细胞的存在，但脆性卵膜卵母细胞的存在并不影响其余正常卵细胞的受精和胚胎发育。Abdelmassih等[14]的研究发现，在前次周期里表现为脆性卵膜的患者在下次ICSI周期中仍有部分卵母细胞表现为脆性卵膜，且在ICSI后表现为较高的退化率。因此，如何避免ICSI时脆性卵膜卵母细胞的退化对改善结局至关重要。Palermo等[7]通过改善注射方式对透明带进行切线穿透，温和地穿透卵膜，在一定程度上可以形成漏斗，保护卵母细胞骨架。Abdelmassih等[14]在研究中对于既往有脆性卵膜卵细胞的患者进入到下一周期，将同一患者所收获的卵细胞随机分组，一组在进针前通过激光将透明带穿透或削薄，另一组使用传统ICSI。结果发现激光穿孔可以降低ICSI时卵细胞退化率。还有报道发现与传统的ICSI相比，Piezo-ICSI(超音振动显微受精法)可以提高ICSI后卵母细胞的存活率和受精率[15-16]。所以对于脆性卵膜卵母细胞采用激光辅助的ICSI或Piezo-ICSI可能是一个较好的选择。

本研究也有一些不足之处，ICSI操作为多人完成，都是主观评估卵膜的韧性，加之操作过程中人员之间有微小的差异，难免对结果造成偏倚；没有针对发生脆性破膜细胞数量具体分组，来观察部分脆性破膜与全部脆性破膜周期的妊娠结局间的差异；未对脆性卵膜组人群进行进一步分析，如卵泡液的激素水平分析及患者的基因水平的检测等。未来可以在这些方面进一步研究。

既往关于脆性卵膜卵母细胞的形成机制尚不清楚，本文研究结果显示其可能与卵母细胞成熟度及质量较差相关。ICSI后部分卵细胞发生退化，导致脆性卵膜组的受精率、可用胚胎率等显著低于对照组，但最终妊娠结局与对照组相比没有显著差异。提示在临床工作中对于脆性卵膜组的患者进入下一次IVF周期时，可以根据卵泡生长发育与激素水平变化，调整促排卵以及板机药物的用量，在保证卵泡大小均匀的情况下，尽量推迟扳机时间，以提高卵母细胞成熟度。实验室人员可以具体测量卵泡液激素水平间的差异，对脆性卵膜卵母细胞尝试延迟注射时间，注射过程中应尽可能地轻柔操作，从而进一步减少卵细胞注射后退化情况的发生，并将胚胎放入Time-lapse中动态观察胚胎发育情况，选择合适的时间将胚胎移植回宫腔或冷冻保存。未来需要积累更多的脆性卵膜卵母细胞方面的数据来进一步分析研究。