不同储存时间、加工及储存对叶菜类饲料亚硝酸盐含量影响研究

陈 明，江弘远，曹 峰

（江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300）

叶菜类饲料是指自然水分含量＞60%的一类饲料，可以为畜禽提供丰富的维生素及矿物质来源。但是叶菜类饲料不合理的储存及加工，会使亚硝酸盐含量增多。亚硝酸盐具有强氧化性，会对身体系统造成危害，长期摄入亚硝酸盐，也会引发亚硝基化合物中毒[1]。因此，人们非常关注叶菜类饲料中的亚硝酸盐污染，控制亚硝酸盐的摄入以及何种方式能减少亚硝酸盐的含量，正成为饲料安全卫生的重要因素[2]。2015年8月5日起，我国开始实施关于《蔬菜中硝酸盐限量》的国家标准，此标准适用于叶菜类、茎菜类、瓜类、豆类、根菜类饲料。但是，叶菜类饲料中的硝酸盐含量与其在各地区生长方式、施肥方式、各地区土壤条件、储存条件和加工方式有关系，因此，不同地域的叶菜类饲料中的硝酸盐含量可能会出现差别[3-4]。因此，检测研究叶菜类饲料中亚硝酸盐含量的多少及其变化规律，以及控制动物体摄入亚硝酸盐量已成为至关重要的措施。试验研究了5种叶菜类饲料在敞口储存7 d，不同加工温度（220、80℃），密封状态下不同储存温度（20、5℃）对叶菜类饲料中亚硝酸盐含量的影响，为养殖者饲养畜禽提供卫生健康的叶菜类饲料提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 叶菜类饲料样品

参加试验的叶菜类饲料种类分别是白菜、青菜、包菜、菠菜、生菜，均购买于江苏省泰州市农贸市场。

1.1.2 试验仪器

试验仪器主要包括：UV-1700SPC型可见光分光光度计（上海美析仪器有限公司），BSA124S型普通分析天平（苏州金钻称重设备系统开发有限公司），JJ224BC型电子分析天平（常熟市双杰测试仪器厂），CH～06型便携式榨汁机（深圳市宝安区沙井广式电器厂）。

1.1.3 试剂及其浓度

亚铁氰化钾溶液（106 g·L-1）；乙酸锌溶液（220 g·L-1）；饱和硼砂溶液（50 g·L-1）；60%乙酸溶液；对氨基苯磺酸溶液（4 g·L-1）；盐酸萘乙二胺溶液（2 g·L-1）；氯化铵缓冲液；亚硝酸钠标准溶液（220 μg·mL-1）；亚硝酸钠标准使用液（5.0 μg·mL-1）。

1.2 试验方法

1.2.1 储存时间

用自来水把各叶菜类饲料样品洗干净，去除烂叶及黄叶，再用去离子水把之前洗净的叶菜类饲料样品洗干净，风干水分。将叶菜类饲料样品储存在室温（20℃）的环境下，并在第1～7天每天分别测定5种叶菜类饲料样品中的吸光度，并将吸光度带入亚硝酸钠标准曲线进行计算，得出亚硝酸钠的含量。

1.2.2 加工方法

将洗净的叶菜类饲料样品进行加工处理，加工方法是放在锅上炒制，温度为220和80℃，按试验步骤操作，最后对于处理好的待测液进行吸光度检测，并计算出亚硝酸钠的含量。放置24 h后，再次测定两种叶菜类饲料样品的吸光度值，并计算出亚硝酸钠的含量。

1.2.3 不同储存温度

将叶菜类饲料样品塑料袋密封，分别在常温（20℃）和冷藏（5℃）环境下储存1、2、3、4、5、6、7 d，每天8:00对密封储存在室温（20℃）和冷藏（5℃）环境下的5种叶菜类饲料分别进行采样，共7 d，进行吸光度检测，并计算出亚硝酸钠的含量。

1.3 待测液的制备

称取叶菜类饲料样品10.00 g→放置在25 mL烧杯中→加饱和硼砂溶液12.5 mL（50 g·L-1）→搅拌均匀→精确加入70℃去离子水30 mL→100℃水浴锅加热15 min→取出冷却至室温→将试样洗入250 mL容量瓶→加入亚铁氰化钾溶液（106 g·L-1）5.0 mL→摇匀→加入乙酸锌溶液（220 g·L-1）5.0 mL→精确加水至刻度，摇匀→放置30 min→上清液过滤，弃去初滤液30 mL→继续过滤→吸取之后过滤所得滤液20 mL于25 mL棕色容量瓶中→加入对氨基苯磺酸溶液（4 g·L-1）2.0 mL→混匀→静置3～5 min→加入盐酸萘乙二胺溶液（2 g·L-1）1.0 mL→精确加超纯水至刻度→混匀→静置15 min，后留作测定吸光度所用。

1.4 亚硝酸钠标准曲线的制作

用刻度吸管精确移取亚硝酸钠标准使用液0、 0.10、 0.20、 0.30、 0.40、 0.50、 0.75、 1.00、1.25 mL→分别置于25 mL棕色容量瓶中→精确加去离子水至12.5 mL→分别加入对氨基苯磺酸溶液（4 g·L-1）2 mL→混匀→静置 3～5 min后→各加入盐酸萘乙二胺溶液（2 g·L-1）1 mL→精确加超纯水至25 mL刻度，混匀→静置15 min。用1 cm比色管，以黑色遮光体调节零点，于波长520 nm处测吸光度，以亚硝酸钠的质量（m）为横坐标，对应的吸光度为纵坐标的标准工作曲线；其回归线方程为y=0.1x+0.001 8，线性相关系数R2=0.997 8，之后每天所测吸光度均要带入此方程进行计算。试验数据如图1所示。

图1 亚硝酸钠标准曲线

1.5 亚硝酸钠含量的测定，采用文献进行测定

称取叶菜类饲料样品10.00 g→放置在25 mL烧杯中→加饱和硼砂溶液（50 g·L-1）12.5 mL→搅拌均匀→精确加入70℃去离子水30 mL→100℃水浴锅加热15 min→取出冷却至室温→将试样洗入250 mL容量瓶→加入亚铁氰化钾溶液（106 g·L-1）5.0 mL→摇匀→加入乙酸锌溶液（220 g·L-1）5.0 mL→精确加水至刻度，摇匀→放置30 min→上清液过滤，弃去初滤液30 mL→吸取余下滤液20 mL于25 mL棕色容量瓶中→加入对氨基苯磺酸溶液（4 g·L-1）2.0 mL→混匀→静置3～5 min→加入盐酸萘乙二胺溶液（2 g·L-1）1.0 mL→精确加去离子水至刻度→混匀→静置15 min，用1 cm比色管，以黑色遮光体调零，含亚硝酸钠0.00 mg的试液作为对照，于波长520 nm处测吸光度。亚硝酸钠含量的计算公式见式1。

式中，X为各叶菜类饲料试样中亚硝酸钠的含量，单位为mg·kg-1（换算而来）；m1表示测定用样液（测完吸光度后带入亚硝酸钠标准曲线进行计算所得出的结果）中亚硝酸钠的质量，单位为μg；m0表示试样（每天称量各叶菜类饲料样品时的质量，精确记录）的质量，单位为g；V1是测定用样液的体积；V0是试样处理液的总体积，单位为mL；以在重复前提下获得的5次独立测定结果的算术平均值表现出亚硝酸钠的含量。

1.6 统计分析

试验数据先用Excel进行初步处理，再用SPSS软件进行单因素方差分析，并进行Duncan's多重比较，结果以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 储存时间对5种叶菜类饲料亚硝酸盐含量的影响

室温敞口储存叶菜类饲料中亚硝酸钠的含量见表1。

由表1可知，在储存温度（室温20～25℃），储存方式（露天储存）7 d中，白菜中亚硝酸钠含量增加了 4×10-4mg，差异显著（P＜0.05）；包菜、青菜、生菜中亚硝酸钠含量增加了7×10-4～1.1×10-3mg，差异显著（P＜0.05）；菠菜中亚硝酸钠含量变化较大，尤其在第6天达到峰值，之后便开始呈下降趋势，差异显著（P＜0.05）。

不同叶菜类饲料7 d，在室温敞口储存下亚硝酸钠含量的变化具体见图2～6。

由图2可知，第1～5天白菜中亚硝酸钠的含量变化有着变化较为平稳的趋势，第3～5天变化甚微，仅有2×10-5mg，第5～6天急剧上升，达到2.18×10-3mg，第6～7天变化甚微，仅有2×10-5mg。

由图2可知，第1～4天，包菜中亚硝酸钠的含量呈缓慢增加趋势，第4～5天急剧上升，达到3×10-4mg，第5～6天变化甚微，仅有4×10-5mg，第6～7天变化较大，达到2×10-4mg。

由图3可知，第1～4天，青菜中亚硝酸钠含量变化不明显，第4～5天，急剧上升，达到4×10-4mg，第5～7天变化较为平缓。

表1 室温敞口储存叶菜类饲料中亚硝酸钠的含量

图2 白菜7 d亚硝酸钠含量的变化

图3 包菜7 d亚硝酸钠含量的变化

图4 青菜7 d亚硝酸钠含量的变化

由图4可知，第1～4天，生菜中亚硝酸钠含量有着较为快速的增长趋势，每天增加1×10-4mg，第4天作为一个分界点，第4～7天生菜中亚硝酸钠含量增加趋势较为平缓。

图5 生菜7 d亚硝酸钠含量的变化

由图5可知，第1～5天中菠菜中的亚硝酸钠含量随着天数的增加而呈现出缓慢上升趋势，但增加甚微，在第5～6天亚硝酸钠含量急剧上升，并在第6天达到峰值，在第6天后便呈下降趋势。

图6 菠菜7 d亚硝酸钠含量的变化

2.2 两种加工温度对5种叶菜类饲料亚硝酸盐含量的影响

采用220和80℃对5种叶菜类饲料进行热处理，亚硝酸盐含量见表2，放置24 h后，5种叶菜类饲料亚硝酸盐含量见表3。

由表2可知，两种加工温度下，5种叶菜类饲料在220℃比在80℃下亚硝酸钠含量要高，包菜、菠菜最多，为1×10-3mg。白菜、青菜最少，为5×10-4mg。

表2 两种加工温度叶菜类饲料中亚硝酸钠的含量 μg·kg-1

由表3可知，采用220和80℃放置24 h后，叶菜类饲料中亚硝酸钠含量变化不大，生菜中亚硝酸钠含量增加最多，增加1.7×10-3mg，青菜中亚硝酸钠增加的最少，增加3×10-4mg，放置时间的增加会导致叶菜类饲料中亚硝酸钠含量随之上升。

2.3 不同储存温度对5种叶菜类饲料亚硝酸盐含量的影响

不同储存温度对5种叶菜类饲料亚硝酸盐含量的影响见表4～5。

由表4可知，在常温密封储存下，白菜、青菜、包菜和菠菜的亚硝酸盐含量在第2～3天均不存在显著差异（P＞0.05）。生菜的亚硝酸盐含量在的第4～5天均不存在显著差异（P＞0.05），菠菜的亚硝酸盐含量在的第1天与第2天均不存在显著差异（P＞0.05）。

由表5可知，在冷藏储存下，白菜和包菜的亚硝酸盐含量在第1天和第2天均不存在显著差异（P＞0.05），青菜、菠菜和生菜的亚硝酸盐含量均差异显著（P＜0.05）。

5种叶菜类饲料在两种储存温度下亚硝酸盐含量7 d的变化见图8～11。

表3 两种加工温度放置24 h后叶菜类饲料中亚硝酸钠的含量 μg·kg-1

表4 密封储存条件下常温（20℃）5种叶菜类饲料亚硝酸盐含量的变化

表5 冷藏（5℃）储存条件下5种叶菜类饲料亚硝酸盐含量的变化mg·kg-1

图7 白菜两种温度放置7 d NO2-含量变化比较

图9 包菜两种温度放置7 d NO2-含量变化比较

图11 生菜两种温度放置7 d NO2-含量变化比较

4讨论

4.1 不同储存时间对5种叶菜类饲料亚硝酸盐含量的影响

试验中5种叶菜类饲料储藏7 d，亚硝酸钠的含量随天数的增加而增加，达到峰值后便有所下降，尤其以菠菜最为明显，新鲜菠菜中亚硝酸钠含量很低，在常温露天储存下，菠菜中亚硝酸钠含量随天数增加而增加，在前5 d呈现出缓慢上升趋势，在第6天达到峰值，并尤其明显，亚硝酸钠含量是第5天的9倍之多，之后便呈现下降趋势。

在试验中，储存时间（0～6 d）及储存温度（室温20～25℃）对叶菜类饲料中亚硝酸盐含量的影响，根据林周孟等人的存放时间及存放温度对叶菜类饲料亚硝酸盐含量的影响的研究可知，在0～6 d的储存时间中，随着储存时间的延长，叶菜类饲料中亚硝酸盐含量均呈增加趋势，但含量和增加趋势有所差异，由于试验天数相对较少，但可以得出，白菜青菜包菜生菜中亚硝酸盐含量随着天数增加而所呈现出的增长趋势大致相同，但菠菜的亚硝酸盐含量，前5 d增长趋势较为缓慢，在第6天达到峰值，之后便呈现下降趋势。不同种类的叶菜类饲料亚硝酸盐含量存在较大差异[5]。从测定的5种叶菜类饲料来分析，根据徐贵华等做的存放时间对叶菜类饲料中亚硝酸盐含量的试验，在正常储存时间（0～6 d）内以及在正常储存温度（室温20～25℃）下，叶菜类饲料中亚硝酸盐含量的积累均不会超过饲料卫生标准（≤4 mg·kg-1）[6]。

图8 青菜两种温度放置7 d NO2-含量变化比较

图10 菠菜两种温度放置7 d NO2-含量变化比较

4.2 不同加工方式对5种叶菜类饲料亚硝酸盐含量的影响

根据梁斌的加工方法及加工后的存放时间对叶菜类饲料亚硝酸盐含量的影响的研究，可知不同的加工方式对不同的叶菜类饲料的亚硝酸盐含量也有不同的影响[7]。热处理220℃的叶菜类饲料中亚硝酸盐含量均比热处理80℃下的叶菜类饲料中亚硝酸盐含量要高5×10-4～1×10-3mg。根据吕元楷的隔夜菜中亚硝酸盐含量的分析研究和张丽华等的叶菜类饲料中硝酸盐和亚硝酸盐含量分析与评价，热处理220℃放置24 h后，白菜，青菜中亚硝酸盐含量要比热处理80℃放置24 h高3×10-4～8×10-4mg，包菜、生菜、菠菜中亚硝酸盐含量要比热处理80 ℃放置24 h高3×10-4～1.7×10-3mg[8-9]。

4.3 不同储存温度对5种叶菜类饲料亚硝酸盐含量的影响

叶菜类饲料在常温密封储存的过程中随着放置时间的延长逐渐增高，而且在第3～4天叶菜类饲料的亚硝酸盐含量出现急速增长，第5天，叶菜类饲料中亚硝酸盐含量下降，第6天达到最大值，然后再次下降。其原因可能是叶菜类饲料中的硝酸盐和亚硝酸盐在一定条件下相互转化，导致亚硝酸盐含量降低[10]。这与王子云等试验结果的变化规律基本一致[11]。菠菜和青菜在常温密封储存的第5天时便开始出现腐叶，说明在常温下叶菜类饲料不宜储存时间过长。

冷藏储存下的叶菜类饲料中亚硝酸盐含量在1～3 d的时候变化不大，亚硝酸盐含量在3～4 d的时候急剧增长，在第6天时达到峰值。但冷藏储存下的叶菜类饲料中的亚硝酸盐含量较低一些，可能是因为在冰箱内低温冷藏的条件下不利于微生物的生长，这与魏颖等的研究结果一致[12]。其中菠菜、青菜和生菜在3～4 d的增长变化较其他的而言增长的变化比较大。

5结论

在室温（20～25℃）敞口储存条件下，叶菜类饲料中的亚硝酸盐含量随着天数的增加而增加。不同加工方式下，热处理220℃的叶菜类饲料中亚硝酸盐含量要高于热处理80℃的叶菜类饲料亚硝酸盐含量，放置24 h后，煮熟叶菜类饲料中的亚硝酸盐含量明显提高，不同储存温度下叶菜类饲料的亚硝酸盐含量的峰值大小顺序为常温密封储存＞冷藏。因此，依据《饲料卫生标准》（2018年5月1日颁布），叶菜类饲料适宜在4 d内饲喂。另外，叶菜类饲料不适合过夜饲喂。储存叶菜类饲料类饲料是最好是选择低温冷藏的储存方式，但储存的时间不宜太长，应≤3 d。