pH敏感型复合水凝胶的设计与药物缓控释评价

胡燕，胡升，吉木色，张尚文，王欣雅，康丽

(中南民族大学 药学院，武汉 430074)

目前，水凝胶作为一种新型药物输送载体，因其优良性质而具有广阔的应用前景.智能水凝胶能对pH[1]、温度[2]、电场[3]、超声[4]和光[5]等条件刺激做出应答，其作为药物载体优势更加明显.生物药物在胃肠道中具有不稳定、半衰期短、低渗透性等缺点[6]，而采用水凝胶作为生物类药物载体是一种有效克服方法[7-9].戊二醛作为明胶交联剂具有细胞毒性[10]，但氧化多糖类可用于蛋白质类天然高分子材料的交联[11].因此，本实验以海藻酸钠和明胶为原料，用氧化海藻酸钠与氯化钙为交联剂，制备了优良性能的复合水凝胶，并探讨了该体系性能、对蛋白质类药物的缓控释效果及释药机制.

1 实验部分

1.1 材料与仪器

海藻酸钠(AR，上海阿拉丁)；壳聚糖(食用级，Mw=1×105，浙江金壳生化)；明胶(药用级，上海阿拉丁)；浓盐酸(AR，信阳市化学试剂)；牛血清白蛋白、考马斯亮蓝(AR，Sigma)；其他试剂均为国药集团化学试剂有限公司AR级.

CP214电子天平(梅特勒-托利多)；冷冻干燥机(北京博医康)；恒温磁力搅拌器(巩义市予华)；傅里叶红外光谱仪(IR，Nicolet 6700，赛默飞世尔)；X-射线衍射仪(XRD，Bruker advance D8型，德国布鲁克AXS).

1.2 水凝胶的制备

1.2.1 氧化海藻酸钠(OSA)的制备

取适量乙醇和蒸馏水，在搅拌下加入海藻酸钠(SA)，搅拌10 min后加入高碘酸钠，室温下避光搅拌，控制氧化时间，加乙二醇终止反应[12,13].再用纯化水透析后抽滤、浓缩、冷冻干燥即得(反应方程式见图1).

图1 氧化海藻酸钠反应方程式Fig.1 Chemical equation of OSA

1.2.2 复合水凝胶的制备

取一定量上述制备好的OSA溶解.称量适量明胶(Ge)分散于溶有OSA的蒸馏水中，后于40℃水浴搅拌至完全溶解并交联.SA溶液与OSA交联的Ge溶液混合均匀，抽气，用滴制法与钙离子交联，再用2%CS包膜，纯化水冲洗后自然风干得复合水凝胶(CH)，制备流程见图2.

图2 复合水凝胶制备示意图Fig.2 Schematic diagram of preparation of composite hydrogel

1.3 OSA交联Ge/SA 复合水凝胶的表征

1.3.1 水凝胶的形貌

拍摄水凝胶新制备、风干后及溶胀后的外部形态，并用扫描电镜观察其内部结构.

1.3.2 红外光谱分析(IR)

将SA、OSA及SA/Ge复合水凝胶冻干样品按一定比例与溴化钾粉末混合压片后测试.

1.3.3 热重分析(TGA)

运用TGA对SA、Ge、OSA及复合水凝胶冻干样品进行检测.温度范围：40～600 ℃，升温速率为10 ℃/min.

1.3.4 X射线分析(XRD)

运用X射线分析仪对海藻酸钠、明胶、氧化海藻酸钠以及复合水凝胶样品进行检测.测试条件：管压40 kV，扫描速度1 °·min-1，衍射角范围4°～40°.

1.3.5 溶胀性能测试

称适量风干水凝胶样品，前2 h在模拟胃液(pH=1.2)中溶胀，再在模拟肠液(pH=7.4)中，直至溶胀平衡.每30 min称重并记录，用下式计算溶胀率：

SR=[(mt-m0)/m0]，

式中：SR为水凝胶的溶胀率；mt为凝胶在模拟液溶胀t时的质量，g；m0为凝胶的初始质量，g.

1.4 释药实验

采用直接包埋法制备载牛血清白蛋白(BSA)水凝胶，风干备用.称若干份风干样品置入锥形瓶中并记录样品质量.加入模拟胃肠液，水浴恒温振荡测试.每隔30 min取样，再补充同体积的模拟液，同法进行其它条件测试.

将取样液用考马斯亮蓝染液染色，在595 nm波长下检测并记录.根据标准曲线计算浓度，按下式计算BSA的累积释药率：

Qn=[(V0ρn+V∑ρn-1/W]×100% ，

式中：ρn为第n次取样中BSA质量浓度；V为取样量；V0为初始体积；W为载药量.

1.5 释药机制

利用复合水凝胶在模拟胃肠液释放BSA的释药数据，进行零级方程、一级方程、Higuchi方程和Ritger-peppas方程拟合.

(1)零级动力学模型：Mt/M∞=k0t，

(2)一级动力学模型：ln(1-Mt/M∞) =-k1t，

(3)Higuchi方程：Mt/M∞=kHt1/2，

(4)Ritger-peppas方程：Mt/M∞=ktn，

式中：Mt为t时间内的累积释放量；M∞为理论上最大的释放量；Mt/M∞为累积释药率；k、k0、k1、kH为速率常数；n为特征参数.

2 结果与讨论

2.1 复合水凝胶的表征结果

2.1.1 水凝胶的形貌表征

图3水凝胶的外部形貌.图3a是刚制备的水凝胶，呈类白色的球状，直径约为4 mm；图3b是风干后的水凝胶，明显收缩，直径约为2 mm，为黄色；图3c是溶胀8 h时的水凝胶，膨胀明显，呈透明状.

图3 复合水凝胶外部形貌Fig.3 External morphology of composite hydrogel

图4a、4b为同一样品用扫描电镜拍摄的水凝胶三维结构，内部为多孔层状，利于载药及吸水溶胀释放药物.

图4 复合水凝胶的扫描电镜图(×100)Fig.4 SEM images of composite hydrogel(×100)

2.1.2 红外光谱分析

图5为复合水凝胶的红外谱图.由图5可见：OSA在1735 cm-1呈现新的吸收峰，为―CHO的伸缩振动，表明SA发生了氧化反应；该峰在SA/Ge复合水凝胶图谱中消失，表明OSA与明胶发生了交联.

图5 复合水凝胶的红外图谱图Fig.5 Infrared spectra of composite hydrogel

根据制备过程以及红外光谱的分析，推测SA/Ge复合水凝胶的交联机理如图6所示.

图6 复合水凝胶的交联机理Fig.6 Crosslinking mechanism of composite hydrogel

2.1.3 热重分析

复合水凝胶的热重分析图见图7.结合图7a，SA和Ge在200～250 ℃较快失重；复合水凝胶在250～300 ℃缓慢失重，说明交联后的水凝胶热稳定有所提高.图7b表明复合水凝胶在两个阶段出现热分解，分别50～250 ℃与300～400 ℃.低温失重是由于复合水凝胶吸附水的损失；高温失重是体系中化学键的断裂，海藻酸钠中相邻的羟基结合脱水，明胶降解.

a) TAG曲线; b) TAG曲线的一阶导数图7 复合水凝胶的热重分析图Fig.7 TAG curve of composite hydrogel

2.1.4 X射线衍射分析

复合水凝胶的X射线衍射分析图谱见图8.由图8可见：SA在14°和23°处有两个尖锐的衍射峰，Ge在20°处有衍射峰；CS在19.5°处有尖锐的衍射峰，但是复合水凝胶未出现较强的衍射峰，说明该体系发生物理化学交联后，原料由晶体结构变为无定型结构.

图8 复合水凝胶的X射线衍射分析图谱Fig.8 XRD spectrogram of composite hydrogel

2.1.5 溶胀性能

在模拟体液中，进行SA/Ge复合水凝胶的溶胀性能测试. 图9a是不同氧化时间的OSA作为交联剂的溶胀曲线图.图中随着氧化时间增加，OSA的氧化程度越高，与明胶交联强度越好，体系越稳定则溶胀率越大，选择氧化时间为6 h的OSA进行下步的研究.图9b中是不同OSA浓度复合水凝胶的溶胀曲线. 图中复合水凝胶溶胀时间在10 h以上并能维持约30 h，因为体系中有化学交联和物理交联，使体系稳定；复合水凝胶溶胀率在pH 1.2中维持在5左右，而在pH 7.4中体系溶胀逐渐增大，最高的溶胀率可达约36.因为在SGF中，H+使得体系表面带有正电荷使--COOH以分子形式存在，分子间排斥力小，而在pH 7.4中，OH-使―COOH解离，分子间排斥力增加，吸水溶胀.当OSA加入量小于0.3%时随OSA浓度增加溶胀率升高；OSA浓度继续增加则交联密度大，溶胀率降低.

a)不同氧化时间；b) 不同交联剂浓度图9 复合水凝胶的溶胀曲线Fig.9 Swelling curves of composite hydrogel

2.2 体外释药测试

选择牛血清白蛋白(BSA)作为体外释药的模型药物, 载药复合水凝胶在不同模拟液下释放BSA模型药物结果见图10. 图10a表示在SBF中缓释效果较好，10 h药物释放率低于60%，随着OSA浓度的增加，缓释效果更好.图10b表示在SIF中释放呈缓慢释放的趋势，体系开始溶胀，释药率约为20%，然后缓慢释放.不同浓度的OSA，后期释药不同，因为高浓度的OSA使交联紧密，网络体系瓦解慢，缓释作用好.图10c表示在SGF中释放药物率整体较低，0.5 h内由于表面药物的释放，释药率约10%，因为在模拟胃液中的溶胀率较低使释药非常缓慢.

a)模拟体液；b)模拟肠液；c)模拟胃液图10 不同pH条件下释放BSA模型药物Fig.10 Cumulative release curve of BSA in different pH condition

2.3 复合水凝胶释药机制研究

根据复合水凝胶在模拟胃液、模拟肠液的释药数据进行拟合. 根据表1和表2拟合的结果，参考相关系数R，Higuchi方程中R的相关度较高，n值均在0.45～0.89之间，所以其释药机制属于骨架型扩散机制释放[14,15].

表1 复合水凝胶释药机制拟合结果Tab.1 Drug release mechanism fitting results of composite hydrogel

表2 复合水凝胶释药机制拟合结果(Ritger-peppas拟合)Tab.2 Drug release mechanism fitting results of composite hydrogel(Ritger-peppas fitting)

3 结论

本文以海藻酸钠和明胶为原料，采用温和的方法以OSA替代戊二醛作为明胶的交联剂，得到一种基于天然材料的pH敏感性水凝胶.该复合水凝胶的溶胀率随着OSA氧化时间的延长呈现线性增大的趋势，随着OSA浓度的增大先增大后减小，溶胀特性好且溶胀率约为36.体系稳定性好，溶胀时间较长，可达到约30 h.在释药实验中，该体系对蛋白质类药物BSA表现出缓释效果，属于骨架型扩散机制释放.此类SA/Ge(OSA交联)复合水凝胶有望作为一种新型的大分子药物缓控释载体.