垂盆草鲜用救治蛇伤优效性评价研究

任永申，张天培，梁帅，李艳秋，梅之南，廖矛川

(中南民族大学 药学院，武汉 430074)

据统计全球每年有五百万人被毒蛇咬伤，而因治疗不及时或无有效治疗手段而致死或致残者约十几万人[1]. 蛇毒主要分为血循毒，神经毒以及混合毒3种类型，其主要成分有蛋白质和多肽类物质、以及碳水化合物、脂类和其他小分子等. 血循毒主要引起心血管功能障碍. 神经毒以神经系统为靶器官，主要干扰神经系统功能，严重时可致命. 譬如，尖吻蝮蛇(Deinagkistrodon)俗称五步蛇，其咬伤后毒液由局部进入伤者血液系统，主要破坏血液循环系统进而造成内脏出血[2]，其毒性主要为血循毒.

抗蛇毒血清是毒蛇咬伤的首选治疗方法，但是也存在明显不足. 首先作为抗体制备的抗蛇毒血清并不具有普适性，且抗蛇毒血清存在储运不便、种类不全的问题，特别是对于偏远地区患者及蛇伤种类不明的野外突发状况，常难以得到直接有效的治疗；其次，抗蛇毒血清治疗只能中和游离毒素，对已造成损伤的毒素无效，且对受损组织的修复无效，需要其他手段共同完成治疗.

中医理论认为，蛇毒分属风火二毒.尖吻蝮蛇毒作为血循毒更偏于火毒的范畴，表现为火毒炽盛，伤津耗液，迫血妄行；甚者邪传心包，或出现邪热耗伤心阳的脱证，或出现邪毒蒙蔽心包的闭证. 临床多用清热解毒、凉血活血的中药治疗[3]. 所用中药鲜药也大多为清热解毒类药物，其在清热、凉血、养阴、安神等方面的作用更强于干药，特别是其取用方便，更适用于野外毒蛇咬伤第一时间救急使用，降低致死、致残率，达到良好的救急与预后效果.

垂盆草SedumsarmentosumBunge是传统的治疗蛇伤药物，最早收载于《本草纲目拾遗》，记载垂盆草善治痈肿、湿郁水肿、虫蛇咬伤[4]. 土家族药匠多将鲜垂盆草洗净捣烂外敷患处或者直接将患肢浸泡鲜药捣碎液中治疗火毒证类毒蛇咬伤[5].本文以垂盆草为研究对象，比较鲜用/干用在尖吻蝮蛇毒致死保护作用和组织损伤治疗的药效差异，探讨垂盆草鲜用成分差异对蛇伤治疗的作用与可能机制.

1 实验部分

1.1 仪器和材料

旋转蒸发器(上海亚荣)；HPLC(Waters，269型)；蛇毒冻干粉(景德镇陈锋公司)；琼脂糖(上海科雅)；新鲜垂盆草采自湖北省英山县大别山区(2019年7月)，经廖矛川教授鉴定为SedumsarmentosumBunge的全草；季德胜蛇药片(精华制药，批号Z3202).

1.2 样品制备

垂盆草鲜汁(XZ)：鲜垂盆草榨汁，抽滤除杂后收集即得(每1 g鲜汁相当于1.54 g鲜垂盆草)；垂盆草鲜汁浓缩物(XZN)：鲜垂盆草榨取汁液，抽滤除杂后于55 ℃减压浓缩得到(1 g鲜汁浓缩物相当于48 g鲜垂盆草)；垂盆草干品水提取物(ST)：取鲜垂盆草同批干燥全草，加8倍量水提取两次后合并滤液，减压浓缩收集得到(1 g相当于22 g鲜垂盆草)；垂盆草醇提取物(CT)：鲜垂盆草同批干燥全草加10倍量70%乙醇提取两次后合并滤液，减压浓缩干燥后得到(1 g醇提物相当于25 g鲜垂盆草).

1.3 垂盆草提取物体外抑制PLA2酶活性试验

1.3.1 蛇毒PLA2酶活性标定

参照文献方法[6]测定尖吻蝮蛇毒PLA2酶活性. 0.5 g琼脂糖倒入装有50 mL 0.05 mol·L-1pH 7.5的NaAc的锥形瓶中，加热溶解；将2 mL卵黄底物与1 mL 0.01 mol·L-1的CaCl2混匀；待琼脂糖溶液温度降至大约50 ℃时，将配好的底物溶液倒入其中, 混合均匀后倒培养皿中，液面高度为5 mm；静置30 min，用5 mm打孔器依次打孔. 取1 mg·mL-1蛇毒冻干粉生理盐水溶液置37 ℃水浴锅孵育45 min, 之后稀释至500、250、125、62.5 μg·mL-1. 每孔加入总量10 μL的蛇毒稀释溶液后，置于湿盒中密封，在37 ℃恒温孵育8 h后取出，测量并记录透明圆环直径. 平行实验3次得平均值.

1.3.2 垂盆草提取物对PLA2酶抑制作用

蛇毒冻干粉分别与垂盆草鲜汁浓缩物(XZN)、水提物(ST)、醇提物(CT)质量比为1∶400、1∶300、1∶200、1∶100、1∶50，用生理盐水稀释成每10 μL含8 μg蛇毒冻干粉的溶液，于37 ℃恒温孵育45 min. 将孵育好的溶液取10 μL即含8 μg约能产生18 mm透明圈直径的蛇毒共孵液加入到1.3.1方法制作的培养皿孔中，置于湿盒内密封，孵育，取出测量并记录圆环直径. 平行实验3次后取平均值后绘制曲线.

1.4 垂盆草提取物对尖吻蝮蛇毒致动物死亡率影响

1.4.1 对腹腔注射蛇毒小鼠死亡率的影响

24只雄性昆明种小鼠，随机平均分为4组. 将小鼠标记好后根据体重腹腔注射相应剂量蛇毒(5 mg·kg-1)，随后0.5 h内各组分别灌胃给予：0.5 g/只生理盐水(MX)、鲜汁浓缩物(XZN)、鲜汁(XZ)、水提浓缩物(ST)、醇提浓缩物(CT). 观察24 h内各组小鼠的生存状况，记录各动物生存时间、计算各组动物死亡率.

1.4.2 与蛇毒共孵育后腹腔注射对小鼠死亡率的影响

36只雄性昆明种小鼠，随机平均分为6组，每组采用蛇毒-药物共孵育法. 将鲜汁浓缩物与蛇毒冻干粉(5.88 mg·kg-1)按400∶1、200∶1(XZN-H、XZN-L)质量比，水提物高、低剂量(ST-H、ST-L)，醇提物浓缩物高、低剂量(CT-H、CT-L)与蛇毒冻干粉在37 ℃水浴环境下孵育45 min，将含有5.88 mg·kg-1蛇毒的共孵育产物给予小鼠腹腔注射，观察并记录各组动物生存状况，死亡时间.

1.5 药物对蛇毒致肌肉组织坏死治疗实验

24只雄性小鼠平均分为4组，并将小鼠右后肢采用Na2S·10H2O脱毛处理. 将15 μL含50 μg蛇毒冻干粉溶液注射到小鼠右腿腓肠肌部位，模拟蛇毒咬伤. 将各组小鼠分别放入装有适量的生理盐水(模型组，MX)、垂盆草鲜汁(XZ)、干垂盆草水提液(ST)、季德胜药片溶液(取8片研钵捣碎后加蒸馏水超声溶解，JDS)中，使右腿刚好浸没. 每浸泡2 h后将小鼠取出用吹风机吹干，放入鼠笼中进食休息，1 h后取出再放入以上药液中浸泡. 每天按此方法重复操作3次. 注射蛇毒30 min后，用细线环绕小鼠右腿测量肿胀右腿周长. 之后于第24、48 h于相同部位重复此测量，评价各组小鼠治疗情况. 采用损伤评分表，分别于注射蛇毒后24、48 h记录小鼠生命体征、生存状况，记录注射部位肿胀程度、溃烂范围，评价小鼠损伤程度. 随时记录小鼠死亡时间，记录48 h生存率，死亡动物于死亡时间取注射部位肌肉组织，存活小鼠于第48 h取出右腿肌肉组织，采用10%甲醛固定、石蜡切片、HE染色、观察组织病理变化.

1.6 垂盆草提取物化学指纹图谱比较

分别称取垂盆草鲜汁浓缩物(XZN)、水提物(ST)、醇提物(CT) 约0.5 g，加入30 mL甲醇超声处理3 h充分溶解，0.45 μm滤膜滤过，备用.

色谱柱选择C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm). 流动相为甲醇(A相)，含0.1%乙酸的色谱纯水(B相)；柱温设定为40 ℃，洗脱梯度程序为：0～50 min，10%～50%A；50～80 min,50%～95%A. 流速1 mL·min-1, 进样量10 μL. 检测波长255 nm.

1.7 统计分析

计量采用Mean±SD表示，采用非参数t-test；计数资料采用组间秩和检验(卡方检验)，统计分析由SPSS软件完成.

2 结果与讨论

2.1 蛇毒PLA2酶活性标准曲线测定

酶活性测定结果表明透明圈直径(y, mm)在蛇毒剂量X，在62.5～500 μg·mL-1之间存在良好的剂量关系：y= -2.356lnX+20.45 (R2=0.9441).

2.2 垂盆草提取物对PLA2酶活性体外抑制作用

垂盆草鲜汁浓缩物、水提物、醇提物对PLA2酶活性体外抑制作用结果显示(图1)，PLA2酶在培养皿上产生的透明圈直径与共孵育质量比X之间关系分别为：y= -3.169lnX+26.621 (R2=0.9543)、y=-1.611lnX+24.452 (R2=0.9201)、y= -2.298lnX+20.3 (R2=0.9647). 在同等剂量下，垂盆草鲜汁浓缩物对蝮蛇蛇毒PLA2酶活性优于垂盆草干品醇提物，更优于垂盆草干品水提物；表明垂盆草鲜用对蛇毒主要酶活性抑制作用显著优于其他提取方式.

图1 垂盆草提取物对PLA2酶活性体外抑制作用量效曲线图Fig.1 Dose-effect curve of Sedum sarmentosum extract inhibitiontest on PLA2 enzyme activity in vitro

2.3 垂盆草提取物灌胃腹腔注射蛇毒对小鼠生存率的影响

腹腔注射蝮蛇蛇毒对照组动物生存率为16.7%，而口服鲜汁浓缩物组生存率为33.3%(P<0.05)(表1).垂盆草鲜用能够降低动物死亡率，药效优于垂盆草干品水提物和醇提物，提示垂盆草鲜用可为蛇伤救治赢得治疗机会，具有重要的实际意义.

表1 垂盆草提取物灌胃给药对腹腔注射蛇毒小鼠生存率的影响Tab.1 The influence of Sedum sarmentosum extract on the survival rate of mice injected with venom intraperitoneally

注：各给药组动物平均生存时间分别与生理盐水组平均生存时间(存活动物生存时间统一记为48 h)进行Mann-Whitney U独立样本非参数检验，**P<0.01，*P<0.05

2.4 垂盆草提取物与蛇毒共孵育后腹腔注射对小鼠生存率的影响

药物与蛇毒共孵育腹腔注射后小鼠生存曲线结果表明(图2)，模型组动物在2 h左右全部死亡，在此蛇毒剂量下，能导致小鼠急性中毒死亡；水提物低剂量组、醇提物低剂量组动物在4 h左右全部死亡，此两种药物提取制备方法在低剂量下对蛇伤小鼠的救治作用不明显；水提高剂量组、醇提高剂量组将动物生存率提高到16.7% (P<0.05)，药物开始起到一定的保护作用，但治疗效果有限，相比水提高剂量组，醇提物高剂量能够显著延长死亡动物生存时间，可为蛇伤治疗争取一定抢救时间；垂盆草鲜汁浓缩物低、高剂量组能够显著延长动物存活时间，且高剂量组能显著提高动物生存率到33.3%(P<0.01)，表明鲜汁大剂量使用对蛇伤蛇伤救治具有重要价值.

各给药组分别与模型组进行Kaplan-Meier生存分析图2 蛇毒-药物共孵育后腹腔注射小鼠生存曲线Fig.2 The survival curve of mice injected intraperitoneally with incubation mixture of venom and drug

2.5 垂盆草提取物对蛇毒致肌肉组织损伤保护

与正常对照组比较，模型组小鼠肌肉组织注射蛇毒后，经24 h浸泡治疗后表现出精神萎靡，眼脸下垂以及活动能力下降的状态，治疗伴随死亡率高达到4/6；伤口出现紫红色淤肿溃烂，肿胀明显，周长达到1.53±0.32 cm，浸泡治疗48 h后未见明显消肿情况；肌肉组织切片显示有较多损伤细胞，但由于模型组动物注射蛇毒后死亡较早，肌肉组织尚未出现进一步的严重损伤.鲜汁浸泡组小鼠浸泡治疗24 h后部分小鼠活动能力减弱，死亡率为1/6，显著低于模型组(P<0.05)；蛇毒注射区域出现红色肿胀，浸泡治疗48 h后肿胀周长较24 h出现明显下降(P<0.05)；细胞一定程度纤维变性和细胞肿胀，但仅有少量组织细胞凋亡，显示药物对蛇毒导致的局部损伤有良好的治疗作用(图3).

水提液浸泡治疗组小鼠24 h治疗后小鼠整体活动能力下降，仅有一只小鼠表现正常活动能力，24 h内死亡率达到3/6，高于鲜汁组；伤口出现紫红色淤肿，浸泡治疗48 h后未见明显的肿胀周长下降的趋势；大量的组织细胞裂解凋亡，纤维组织细胞出现严重损伤变性.表明垂盆草干品水提液对逆转蛇毒导致的局部损伤作用欠佳，但能延长动物生存时间，动物在生存过程中蛇毒继续危害组织，造成严重的局部损伤和溃烂，局部病理状况甚于模型组.

阳性对照组季德胜蛇药组动物经浸泡治疗48 h后生理状态，活动能力表现趋于正常；肿胀周长下降趋势明显；有轻微组织细胞肿胀，仅有少量细胞发生裂解凋亡；表明该药对蛇伤具有良好的治疗作用.

表2和表3显示肌肉注射蛇毒后出现肿胀溃烂，经过浸泡治疗后各组表现出不同的治疗效果. 其中，鲜汁浸泡组对动物生存状态、生存率、肌肉组织保护作用均优于蒸馏水浸泡组和水提液浸泡组；季德胜药液浸泡组对蛇伤治疗效果优于其他各组，这与其复方中大量使用同类鲜草药汁入药有关.

图3 浸泡治疗各组小鼠组织病理切片Fig.3 Histopathological results of mice with the immersion therapy

表2 组织损伤症状积分表
Tab.2 Score table for tissue damage evaluation

症状和体征 0分1分2分3分肿胀颜色溃烂面积正常颜色无明显溃烂皮下出血,红斑 溃烂面积较小紫红色水肿溃烂面积中等 水肿伴随组织严重溃烂溃烂面积较大

表3 各组药液浸泡治疗情况Tab.3 Immersion therapy results of each group

注：治疗48 h与治疗24 h肿胀周长比较，**P<0.01;症状积分各给药组与蒸馏水浸泡组比较，##P<0.01，#P<0.05；伴随死亡率使用Kaplan-Meier方法检验，※※P<0.01，※P<0.05

2.6 垂盆草样品HPLC指纹图谱

垂盆草鲜汁浓缩物与垂盆草水提物、醇提物在化学成分上差异明显(图4). 从色谱峰数目上看，垂盆草干品水提物色谱峰数目最少，溶出化学成分最少，因而可以发挥生物活性的成分也最少，这可能是其抗蛇毒药效活性较弱的原因之一；垂盆草干品醇提物指纹图谱中色谱峰数目较多、含量较高，提示醇提方法对垂盆草干品提取效率较高，从而可以参与药效作用发挥的化学成分更多，因而其具有一定的抗蛇毒活性. 另外，从化学指纹图谱上看，鲜垂盆草色谱峰数目和含量介于水提物和醇提物之间，但其发挥的抗蛇毒药效作用最强，提示鲜垂盆草抗蛇毒药效物质应不限于上述化学成分，而与其在鲜用取汁状态下保留更多其他种类化学成分、初生代谢产物及其他生命活性物质有关，需要进一步深入研究.

图4 垂盆草样品HPLC指纹图谱Fig.4 The HPLC fingerprint of Sedum sarmentosum extract sample

3 结语

鲜垂盆草能够降低蛇伤动物死亡率，但经口给药，药物需要吸收代谢过程，因而在治疗上需要一定时间发挥药效；蛇毒损伤造成动物腹腔大量出血致死，给予鲜垂盆草汁灌胃后出血有所减少. 蛇伤的救治一方面在于能够迅速减少未结合蛇毒，另一方面在于降低蛇毒已经造成损伤的修复.研究表明，天然药物中黄酮类、三萜类、单宁类以及固醇类化合物具有很好的抗蛇毒活性[6]，并在垂盆草中发现上述几种类型成分[7]. 课题组前期利用低场核磁共振及成像技术发现了新鲜中药干燥过程中水分及化学成分存在复杂的变化情况规律，研究表明中药鲜用更具有物质基础的多样性及生命活性的优效性[8]. 本研究中，垂盆草鲜汁相比干药在化学指纹图谱中的成分更为丰富，且鲜汁中含有丰富的鞣质和黄酮类成分如山奈酚7-O-(6-O-丙二酰)-葡萄糖苷等具有一定Ca2+离子螯合能力的化合物[9]，且这类化合物区别于EDTA的Ca2+死螯合作用，可在螯合Ca2+离子后被胞浆酶降解或因其本身不稳定的螯合作用进一步释放出来而起到促进凝血的双重调节作用，因而对蛇毒造成的出血致死具有较好的疗效.

本文从垂盆草鲜品/干品提取物对蛇毒酶活抑制、致死保护、局部损伤治疗作用等几个层面评价了抗尖吻蝮蛇毒活性差异，验证了垂盆草抗蛇毒作用及鲜用功效更优的传统认知，对于蛇伤的野外急救、降低致死致残率和提高治疗预后具有重要意义,对其他中药鲜用优效性研究也具有参考意义.