黄连中抗肿瘤生物碱的计算机虚拟筛选研究

刘新桥，王静，袁桥玉，宋炜，胡贝，李竣

(1 中南民族大学 药学院，武汉 430074；2 武汉职业技术学院 生物工程学院，武汉 430074)

黄连为毛莫科植物黄连CoptischinensisFranch.、三角叶黄连CoptisdeltoideaC. Y. Cheng et Hsiao 或云连CoptisteetaWall.的干燥根茎，主要分布于湖北、重庆、四川、云南、贵州、湖南、陕西南部. 黄连根茎味苦，性寒，归心、胃、肝、大肠经，具清热泻火、燥湿解毒之功效[1]. 临床上多用于治疗痢疾、急性胃肠炎、慢性腹泻、呼吸道感染以及各种炎症. 近年来，大量药理研究表明，其在抗癌、抗心律失常、降血糖等方面亦有明显作用[2,3]，其作用主要与其根茎所含的生物碱(约占根茎的4%～ 8%)有关[1]. 黄连中所含化学成分黄连总碱和小檗碱对多种体外培养的食道癌、结肠癌等细胞生长有明显的抑制作用[4].

与常规筛选和高通量筛选需要的样品制备和高成本相比，分子对接发现药物作用靶点的过程更加简单和高效，对确定化合物的作用靶点和阐述作用机制具有提示作用.本研究针对中药药效弱、多靶点的特点，基于计算机虚拟筛选技术，从黄连生物碱中筛选抗肿瘤活性的天然配体和可能的作用靶点，为黄连抗肿瘤作用机制研究提供理论基础和参考.

1 资料与方法

1.1 资料来源

蛋白质数据库(PDB，网址：http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do)；小分子化合物结构下载(PubChem，网址：https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，网址：http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；Sybyl 1.0软件(美国Tripos公司)；Discovery Studio 2017 R2 Client(DS，网址：https://www.3dsbiovia.com/).

1.2 方法

1.2.1 小分子配体的准备

以“黄连”作为关键词，从TCMSP数据库中搜索生物碱类化学成分，从Pubchem数据库下载相应化合物结构，用Chem3D转为mol2格式，建立配体小分子化合物库. 所有配体小分子均采用分子力学程序Minimize进行结构优化，赋予Tripos力场及加载Gasteiger-Huckel电荷，优化后得到的稳定构象保存为mol2格式.

1.2.2 受体结构信息来源及处理

本文所用蛋白见表1，从PDB中搜索目标靶蛋白并下载其三维结构，对靶蛋白用Application 中的Docking模块进行修饰、加氢及加载AMBER FF99电荷，并根据靶蛋白复合物中配体确定对接的活性位点，将处理后的蛋白保存.

1.2.3 分子对接

以生物碱类化合物为配体，以17个抗肿瘤作用的靶点为受体，利用sybyl1.0软件Surflex-dock模块进行分子对接，对接的结果以打分函数Total Score 给出，以mol2格式保存. 利用SYBYL 分子对接模块的Total Score 打分函数对配体分子进行筛选，Total Score 综合考虑了极性作用、疏水作用、焓和熔剂化等因素，该值越大，对接复合物越稳定，说明小分子化合物与大分子蛋白质的匹配结合作用越好.

1.2.4 数据分析与图像处理

采用Discovery Studio软件中receptor-Ligand Interactions模块对分子对接结果进行分析.

表1 对接研究使用的受体蛋白 Tab.1 The receptor protein of molecular docking

2 结果

2.1 生物碱成分搜索结果

在TCMSP数据库中，共搜索到黄连中的21个生物碱成分，配体分子信息见表2.

表2 配体分子的名称及信息Tab.2 Name and information of ligands molecule

2.2 分子对接结果

下载21个黄连生物碱小分子配体与靶蛋白进行对接， 筛选出具有较好结合活性的化合物9个，分别为：小檗碱、非洲防己碱、表小檗碱、格陵兰黄连碱、黄柏碱、氧化小蘖碱、巴马亭、甲基黄连碱、N-反式-阿魏酰酪胺. 其中非洲防己碱、巴马亭、N-反式-阿魏酰酪胺与多个靶标蛋白有结合活性. 小檗碱与靶蛋白组蛋白去乙酰化酶(HDAC)结合最好，非洲防己碱、格陵兰黄连碱、巴马亭、N-反式-阿魏酰酪胺与环氧合酶2(COX-2)结合最好，表小檗碱、氧化小蘖碱、甲基黄连碱与3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)结合最好，黄柏碱与Polo样激酶2(PLK-2)结合活性最好. 该结果表现出的多成分对靶标点的共同作用的特点，为阐述黄连抗肿瘤作用机制研究提供了理论基础，各成分也可作为靶蛋白抑制剂先导化合物加以研究. 黄连生物碱成分与靶蛋白具体对接结果见表3，结合较好的6个代表性蛋白复合体的相互作用力分析见图1 ～ 6.

2.3 对接结果分析

2.3.1 小檗碱与组蛋白去乙酰化酶相互作用

小檗碱与17个靶蛋白进行分子对接后，与组蛋白去乙酰化酶结合最好，Total score为7.0813；其对接效果见图1. 从图1c可以看出，疏水相互作用力在此对接中起重要作用；同时小檗碱与HIS21形成了氢键，与HIS170、LEU265形成C—H键.

图1 小檗碱与组蛋白去乙酰化酶分子对接效果图Fig.1 Docking renderings of berberine with HDAC

2.3.2 非洲防己碱与环氧合酶-2相互作用

非洲防己碱与17个靶蛋白进行分子对接后，与环氧合酶-2结合最好，Total score为7.5269(图2). 从图2c可以看出，疏水相互作用力在此对接中起重要作用；同时非洲防己碱与GLN192、PHE518、SER530形成了氢键，与SER353和GLN192形成C—H键.

图2 非洲防己碱与环氧合酶-2分子对接效果图Fig.2 Docking renderings of columbamine with COX-2

2.3.3 表小檗碱与3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1相互作用

表小檗碱与17个靶蛋白进行分子对接后，与3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1结合最好，Total score为7.1675；其对接效果见图3. 从图3c可以看出，疏水相互作用力在此对接中起重要作用；同时表小檗碱与ASP223、LYS111形成了氢键，与LYS163、GLU209、ASN210和ASP223形成C—H键.

2.3.4 黄柏碱与Polo样激酶-2相互作用

黄柏碱与17个靶蛋白进行分子对接后，与Polo样激酶-2结合最好，Total score为7.2188；其对接效果见图4. 从图4c可以看出，疏水相互作用力在此对接中起重要作用；同时黄柏碱与GLU131、SER134形成了氢键.

2.3.5 巴马亭与环氧合酶-2相互作用

巴马亭与17个靶蛋白进行分子对接后，与环氧合酶-2结合最好，Total score为7.9135；其对接效果见图5. 从图5c可以看出，疏水相互作用力在此对接中起重要作用；同时巴马亭与SER530、ARG513形成了氢键，与LEU352、GLN192形成C—H键.

2.3.6N-反式-阿魏酰酪胺与环氧合酶-2相互作用

N-反式-阿魏酰酪胺与17个靶蛋白进行分子对接后，与环氧合酶-2结合最好，Total score为8.7050；其对接效果见图7. 从图6c可以看出，疏水相互作用力在此对接中起重要作用；同时N-反式-阿魏酰酪胺与GLN192、PHE518、SER530形成氢键.

图3 表小檗碱与3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1分子对接效果图Fig.3 Docking renderings of epiberberinewith PDK1

图4 黄柏碱与Polo样激酶-2分子对接效果图Fig4 Docking renderings of phellodendrinewith PLK2

图5 巴马亭与环氧合酶-2分子对接效果图Fig. 5 Docking renderings of palmatinewith COX-2

图6 N-反式-阿魏酰酪胺与环氧合酶-2分子对接效果图Fig.6 Docking renderings of moupinamide with COX-2

3 讨论

Sybyl软件是研究者从传统中草药中寻找到相关靶点的潜在活性化合物并确定其药理活性的重要手段[5]. 选取与肿瘤细胞生长周期相关的蛋白EGFR 、VEGFR2[6]，与肿瘤细胞凋亡相关的蛋白COX-2[7]、PLK-1、PLK-2[8]和肿瘤细胞端粒酶等17个相关靶标为筛选靶点，运用Sybyl软件的Surflex-dock模块对中药黄连中21个生物碱成分进行筛选，筛选出3个具有多靶点抗肿瘤作用的活性分子活性分子非洲防己碱、巴马亭、N-反式-阿魏酰酪胺. 从计算机虚拟筛选的角度验证了中药黄连在抗肿瘤作用中，表现出多种成分对靶标点的共同作用的特点. 然后运用Discovery Studio Visualizer 软件对结合最好的蛋白复合物相互作用力进行分析，证实氢键和疏水作用力在各自的对接中起着重要的作用. 已有研究显示，非洲防己碱对人肝母细胞瘤HepG2细胞增殖有一定的抑制作用；氨基酸Ser530在环氧合酶-2催化过程起到关键的作用[9]. 从2c图可以看到，非洲防己碱与环氧合酶-2核心氨基酸均有相互作用. 黄连活性成分与靶蛋白的核心氨基酸存在相互的作用力, 而二维图可以帮助了解黄连活性成分与受体对接的作用力和位置结合等情况，有助于阐述抗肿瘤作用机制.

本文建立的方法弥补了传统药理学实验方法的不足，提高了先导化合物的发现效率，为抗肿瘤中药多靶点作用的研究奠定了基础.