血清miR⁃191⁃5p和miR⁃20a⁃5p联合作为脑卒中后认知功能障碍诊断标志物的研究

王振杰 谷诗浓 刘毓佳 周凡萍 黄赛娥

1福建中医药大学（福州350122）；2福建中医药大学附属康复医院（福州350003）；3福建省康复技术重点实验室（福州350003）；4武汉科技大学附属孝感市中心医院（武汉432000）

脑卒中后认知障碍（post⁃stroke cognitive im⁃pairment，PSCI）是指急性脑血管病导致的各种类型和不同程度的认知功能减退，是血管性认知障碍的重要组成部分［1-2］。microRNAs（miRNAs）是一种单链非编码含有20～24个核苷酸的小分子RNA，通过与信使RNA（mRNA）的3‘UTR或5′UTR结合，促进或抑制mRNAs的翻译，从而达到对机体功能的调节［3-4］。研究［5-7］表明，miR⁃191⁃5p和miR⁃20a⁃5p都与改善脑卒中后缺氧状态下神经元细胞死亡，促进神经元突触可塑性形成，缓解认知障碍相关。因此，血清miR⁃191⁃5p和miR⁃20a⁃5p具备成为诊断PSCI的生物标记物的潜能。综上所述，本研究主要目的是探讨miR⁃191⁃5p联合miR⁃20a⁃5p对于PSCI患者的诊断价值，分析临床意义。

1 资料与方法

1.1 受试者及纳排标准 2017年10月至2018年4月从福建中医药大学附属康复医院招募了72例卒中患者和37例年龄匹配对照（age⁃matched control，AMC）受试者。卒中患者和对照者的年龄，性别和受教育程度相匹配。所有受试者年龄在45岁至75岁之间，本研究已经通过福建中医药大学附属康复医院伦理委员会的批准，所有研究对象已签署知情同意书。

PSCI入选标准：（1）受试者有神经影像学（CT或MRI）提供的脑血管疾病证据，且CT或MRI提示病变部位在基底节区，无广泛性病灶；（2）蒙特利尔认知评估量表（montreal cognitive assessment，MoCA）评分<26（对于受过教育不超过12年的人的评分进行1分校正）；（3）所述卒中是患者首次发生并且在本研究前1年内发生；（4）患者生命体征稳定。脑卒中后认知正常（post⁃stroke cognitive normal，PSCN）组纳入标准与PSCI组标准相同，但MoCA评分≥26。AMC组纳入标准包括：（1）受试者主诉没有认知功能障碍。（2）MoCA评分≥26 PSCI组排除标准是：（1）存在其他可引起认知障碍的疾病，如阿尔茨海默病、额颞叶痴呆等脑退行性疾病者；脑肿瘤、脑外伤或脑寄生虫病及其他原发性认知功能障碍性疾病；（2）医生或家属确认患者卒中前长期表现出认知功能障碍或在卒中前使用过与认知功能障碍有关的药物；（3）影响认知检查的严重言语，视力，听力障碍或精神障碍的症状；（4）贝克抑郁量表（beck depression inventory BDI）得分>13；（5）酒精或药物滥用；（6）存在以下任何一种情况：心力衰竭，呼吸衰竭或其他器官衰竭；（7）孕妇和哺乳期妇女。PSCN组排除标准与PSCI组相同。AMC组排除标准包括6个条件：（1）阿尔茨海默症、额颞叶痴呆、脑血管疾病和其他可引起认知障碍的中枢神经系统疾病；（2）另外5个条件与PSCI组的最后5个条件一致。

1.2 血清样本 在受试者住院后3 d内，在每个受试者的无添加剂的真空血液管中收集血液样品（5 mL）。将试管垂直保持30 min以形成凝块，之后在室温（15～25℃）下以3 000 r/min离心10 min，然后在4℃下以13 000 r/min离心10 min。收集处理后的血清并储存在-80℃直至进一步分析。

1.3 RNA提取和逆转录 使用miRNA纯化试剂盒（北京艾德莱公司，RN4601），按照其中的使用说明书来分离提取miRNA。使用NanoDrop2000c分光光度计（德国，Thermo）检测RNA浓度和纯度。RNA浓度范围为20～102 ng/L。通过测量260～280 nm处的吸光度来检测RNA纯度，其范围为1.81～2.01。使用miRNAcDNA试剂盒（cwbiotech，CW2141）进行逆转录。内参选择miR⁃16（序列：TAG CAG CAC GTA AAT ATT GGC GT）。

1.4 实时荧光定量PCR 使用实时荧光定量（qRT⁃PCR）检测miRNAs，使用ChamQTM SYBR qPCR Master Mix（MR101⁃02）（南京诺唯赞生物科技有限公司），把cDNA浓度按照1∶3稀释。具体操作按照相应的使用说明书。

1.5 统计学方法 使用SPSS 25.0统计软件包（IBM）进行所有统计分析。计量数据由均值±标准差表示。3组间比较，符合正态分布使用单因素方差分析，不符合正态分布使用Kruskal⁃Wallis H（K）检验。两组间比较符合正态分布使用两独立样本t检验，不符合正态分析使用Mann⁃WhitneyU检验。计数资料由χ2检验。通过Spearman进行相关分析以估计miR⁃191⁃5p和miR⁃20a⁃5p水平分别与MoCA评分之间的相关性，得到相关系数r。一般认为，r>0是正相关，r<0是负相关，r=0是非线性相关（零相关）。如果|r|≥0.7表明两者高度相关；如果曲线0.7>|r|≥0.4表明两者中度相关；如果0.4>|r|≥0.2表明两者低度相关［8］。产生ROC曲线，并分析曲线下面积（area under curve，AUC）以评估miR⁃191⁃5p和miR⁃20a⁃5p的诊断性能。根据ROC曲线获得最佳诊断值（Cut⁃off point），并计算所有4个计数，即真阳性数量（true positive，TP），假阳性数量（false positive，FP），真阴性数量（true negative，TN）和假阴性数量（false negative，FN）。笔者计算灵敏度，特异性如下：灵敏度=TP/（TP+FN）；特异度=TN/（TN+FP）。一般认为，AUC在0.5～1.0的区间内，AUC位于0.5～0.7之间，具有较低的诊断价值；AUC在0.7～0.9之间，具有中等的诊断价值；AUC在0.9～1.0之间，具有较高的诊断价值［8］。

2 结果

2.1 患者特点 显示了miR⁃191⁃5p和miR⁃20a⁃5p的人口学信息、生化数据和CT值；患者的一般资料在AMC、PSCN和PSCI之间差异无统计学意义（P>0.05）。以miR⁃16为内对照，各组间miR⁃16 Ct值差异无统计学意义（P=0.724，表1、2）。

2.2 血清miRNA相对表达水平 miR⁃191⁃5p和miR⁃20a⁃5p表达水平在3组中显著不同（P<0.05）。（1）miR⁃191⁃5p在PSCI组表达最高，然后是PSCN组和AMC组，在PSCI和PSCN组（P<0.05）与PSCI和AMC组（P<0.05）之间的成对比较中检测到PSCI组的miR⁃191⁃5p表达差异有统计学意义；与其他两组相比，PSCI患者血清中miR⁃191⁃5p的相对表达显著上调。（2）miR⁃20a⁃5p在PSCI组表达最高，然后是AMC组和PSCN组，在PSCI和PSCN组与PSCI和AMC组之间的成对比较中检测到PSCI组的miR⁃20a⁃5p表达差异有统计学意义（P<0.05）；与其他两组相比，PSCI患者血清中miR⁃20a⁃5p的相对表达显著上调（表2）。

表1 PSCI、PSCN和AMC组人口学数据的分布Tab.1 Distribution of demographic data in PSCI,PSCN and AMC groups ±s

表1 PSCI、PSCN和AMC组人口学数据的分布Tab.1 Distribution of demographic data in PSCI,PSCN and AMC groups ±s

注：a，计量资料且有一组不符合正态分布，3组间比较采用Kruskal⁃Wallis H（K）检验；b，计量资料且均符合正态分布，方差齐，两组间采用独立样本t检验；c，计量资料且有一组不符合正态分布，两组间采用Mann⁃Whitney U检验；d，计数资料，χ2检验

特征年龄（岁）a受教育水平（年）a病程（d）b MOCA评分c性别（例）d男 女脑卒中类型（例）d脑梗死脑出血高血压病史（例）dd糖尿病史（例）dd高脂血症史（例）dd心脏疾病史（例）dd吸烟史（例）dd PSCI组（n=36）64.31±1.228 6.67±0.352 50.53±0.762 12.92±0.814 21 15 15 21 22 17 16 9 18 PSCN组（n=36）65.00±1.247 6.56±0.489 50.94±0.656 26.56±0.151 21 15 16 20 23 17 17 9 17 AMC组（n=37）62.27±0.968 6.65±0.345 28.30±0.133 17 20 19 14 19 10 17 P值0.382 0.943 0.560<0.01 0.470 0.812 0.519 0.646 0.838 0.974 0.939

表2 AMC、PSCN和PSCI组两种血清相对表达量及miR⁃16Ct值Tab.2 Relative expression and miR-16Ct value of two kinds of serum in AMC,PSCN and PSCI groups ±s

表2 AMC、PSCN和PSCI组两种血清相对表达量及miR⁃16Ct值Tab.2 Relative expression and miR-16Ct value of two kinds of serum in AMC,PSCN and PSCI groups ±s

注：对数值进行对数运算log102⁃ΔCt进而转变成规范的Ct值，miR⁃16用作内部参照。a，计量资料且至少有一个不符合正态分布，3组比较用Kruskal⁃Wallis H（K）检验；b，PSCI组和AMC组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；c，PSCI组和PSCN组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；d，AMC组和PSCN组相比，差异无统计学意义（P>0.05）

miR⁃16Ct值a miR⁃191⁃5pa miR⁃20a⁃5pa AMC（n=37）29.788±0.470-0.577±0.672 0.331±0.061 PSCN（n=36）29.379±0.454-0.577±0.094 0.166±0.103 PSCI（n=36）29.517±0.390-0.250±0.098bcd 0.743±0.076bcd P值0.724 0.047<0.001

2.3 认知功能与miRNAs水平相关性 笔者分析了MoCA评分与血清miR⁃191⁃5p和miR⁃20a⁃5p水平之间的相关性。（1）PSCI组和PSCN组中Spearman相关分析结果表明miR⁃191⁃5p的相对表达与MoCA评分之间呈中等强度负相关（r=-0.488，P<0.01）；（2）PSCI组和PSCN组中Spearman相关分析结果表明miR⁃20a⁃5p的相对表达与MoCA评分之间呈中等强度负相关（r=-0.624，P<0.01）。见表3。

表3 MoCA得分与miRNAs相对表达量间的相关分析Tab.3 Correlation analysis between MoCA score and relative expression of miRNAs

2.4 miRNAs筛选PSCI的诊断性能 通过ROC分析来比较血清miR⁃191⁃5p和miR⁃20a⁃5p以及两者联合对于PSCI的诊断能力。miR⁃191⁃5p联合miR⁃20a⁃5p的AUC（95%CI），灵敏度和特异度均明显高于miR⁃191⁃5p或miR⁃20a⁃5p单独的AUC，灵敏度和特异度（P<0.05）。见表4、图1。

表4 miR⁃191⁃5p、miR⁃20a⁃5p以及两者联合的ROC曲线分析Tab.4 ROC curve analysis of miR⁃191⁃5p,miR⁃20a⁃5p,and their combination

图1 ROC曲线Fig.1 ROC curve

3 讨论

脑卒中有着极大的危害，我国脑卒中发病率持续上升，平均每年增长8.3%，发病率为403.09/10万［9］，PSCI的的发病率达到80.97%［10］。PSCI对于患者和家庭造成了极大的困难，因此对于PSCI客观有效诊断具有极其重要的意义。MoCA是通过循证医学验证的的认知障碍筛查，已获得国际专家的认可［11］，该筛选量表由NASREDDINE等［12］改进和建立。与简易精神状态检查（mini⁃mental state examination，MMSE）相比，MoCA更加重视执行功能和注意力的评估，并且敏感度更高，因此是一种重要的临床认知功能工具［12］。然而，MoCA结果受性别，年龄和教育水平的影响，也受到患者主观因素的影响。目前对于PSCI缺乏比较客观的诊断指标。因此本课题针对脑卒中患者，探究了联合血清miR⁃191⁃5p和miR⁃20a⁃5p水平对PSCI诊断的价值，为临床实践提供了客观有效的参考指标。

有研究［13-14］显示，miRNA能够在血循环中稳定存在，且其表达能够随着机体病理生理的改变而发生上调或下调。目前研究［14-15］表明miRNA参与调控了脑高级功能（如学习，记忆和情绪等）。而先前的研究也报道了miRNA的表达与神经元突触可塑性以及认知相关的疾病有关［16-17］，其主要是通过提高基因表达或者减少蛋白的翻译进而调控神经元突触的可塑性［18］。LILY等［19］研究发现，miR⁃191⁃5p过度表达能够抑制脑源性神经营养因子（BDNF）的水平，进而抑制突触可塑性。BEVERIDGE等［20］研究表明miR⁃20a⁃5p上调可降低抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤2（BCL 2）等促进神经元分化因子的表达，提示miR⁃20a⁃5p是脑发育和神经元分化过程中的关键调节因子，对于神经突触可塑性有着重要作用。miR⁃191⁃5p和miR⁃20a⁃5p不仅跟神经元细胞突触可塑性有关，而且与认知学习记忆认知有关。DU等［5］研究显示，miR⁃191⁃5p过度表达会促进细胞死亡，抑制miR⁃191⁃5p可以降低中脑动脉闭塞大鼠的梗死面积，并且能够缓解因缺血缺氧导致的细胞死亡，从而改善认知功能障碍。这与本研究相一致，PSCI患者血清中的miR⁃191⁃5p含量明显高于PSCN患者。miR⁃191⁃5p的下调不仅能够缓解缺血缺氧导致的神经元细胞死亡，而且HU等［6］在研究中发现miR⁃191⁃5p的下调与维持小鼠海马结构重建密切相关，有利于改善记忆和认知障碍。此外，POITZ等［7］实验表明，miR⁃20a⁃5p通过调节缺氧诱导因子1a（hif⁃1a）的表达，减少卒中后缺氧状态下神经细胞死亡。综上所述，miR⁃20a⁃5p和miR⁃191⁃5p的下调似乎都与缓解缺血缺氧状态下的神经元细胞死亡相关，从而改善认知障碍。不仅如此，MYRRHE等［21］发现miR⁃191⁃5p和miR⁃20a⁃5p均与海马神经元发育和神经元活动变化有关，表明两者可能参与调控神经元突触可塑性形成，甚至脑高级活动功能。因此，miR⁃191⁃5p和miR⁃20a⁃5p可能都与缓解缺血缺氧状态下神经细胞死亡，促进神经元突触可塑性形成以及记忆等脑高级活动功能有着密切的联系，但是目前的研究多集中于基础实验，临床研究较少，而本研究观察了两者联合对于PSCI的诊断价值，其研究是具有一定临床意义。

本研究结果显示在PSCI组中，miR⁃191⁃5p和miR⁃20a⁃5p的表达水平均高于PSCN组和AMC组，进一步通过ROC曲线分析表明miR⁃191⁃5p联合miR⁃20a⁃5p对于诊断PSCI的AUC、灵敏度和特异度均高于单一诊断，提示miR⁃191⁃5p和miR⁃20a⁃5p联合诊断的可能更具诊断价值，有望成为PSCI早期鉴别诊断的血清生物学标记物。