重症肺炎肺泡灌洗液微小核糖核酸-127的表达水平及临床意义

杨 哲 尹武燕 冯广革

重症肺炎是一种中老年人常发的危重急症，临床症状为高热、呼吸急促、肺部湿啰音等，容易又诱发低血氧症、中毒性休克、呼吸衰竭等严重的并发症，预后较差[1]。目前临床针对重症肺炎的治疗主要以抗感染联合支气管肺泡灌洗(broncho alveolar lavage, BAL)为主，收集患者的肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid, BALF)并检测其中炎症因子等生物标志物，可了解患者的病情状况。微小RNA分子(micro RNA, miRNA)是不参与编码的RNA分子(noncoding RNA, ncRNA)，对真核细胞的基因表达、细胞发育分化和个体发育等多方面起调控作用。有研究表明，在BALF中可检出检出miRNA-127[2-3]。关于miRNA-127在重症肺炎中的表达研究已有报道，且也证实miRNA-127参与其相关基因在细胞水平上抑制肺部感染和炎症反应，但都是基于使用BALF治疗后的一次性检测研究，而未对治疗过程中进行动态监测，这无疑会使结果产生偏倚。故本研究态监测重症肺炎患者BALF中miRNA-127表达的变化情况，并结合患者的炎症指标，探讨miRNA-127的诊断效能，现报道如下。

资料和方法

1.一般资料 选择2017年1月至2019年5月，我院重症医学科收治的重症肺炎患者102例作为研究对象；纳入标准：①年龄>18岁；②经院内高年资医师按《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南(2016年版)》[4]、《中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南(2018年版)》[5]诊断标准确诊为重症肺炎者；③患者均符合支气管肺泡灌洗治疗的适应症，且治疗期间至少行3次气管镜肺泡灌洗治疗。排除标准：①年龄<18岁；②合并有囊性纤维病等严重肺部疾病；③合并其他严重感染者或类风湿关节炎、血管炎等患者；④BALF收集操作不合格者；⑤气管镜肺泡灌洗≤2次者。⑥存在支气管灌洗治疗禁忌症者；本研究已经本院医学伦理委员会批准通过，所有检查治疗手段以及研究目的已提前告知患者和家属，患者或家属已签署知情同意书。

2.治疗方法和预后判断 (1)所有患者采取综合治疗：给予营养支持吸氧、控制体温、支气管扩张剂、促进气道分泌物排出、改善肺通气，使用敏感抗生素，改善循环功能，必要时采取机械通气，防止水、电解质平衡紊乱。BAL按照2017年中华医学会呼吸病学分会制定的《肺部感染性疾病支气管肺泡灌洗病原学检测中国专家共识》[6]进行。

(2)根据治疗10 d后的临床效果分为预后良好组和预后不良组，其中经治疗后10 d后临床症状、体征、实验室检查及病原学检查共4项检查显示痊愈、显效或进步的患者为预后良好组；综合治疗10 d后无效或死亡的患者为预后不良组。临床效果评价标准：①四项检查显示恢复正常则判定为痊愈；②病情出现明显好转，但四项检查至少有1项未完全恢复至正常则判定为显效；③治疗后病情存在好转，但4项检查均为达到显效标准判定为进步；④治疗后症状缓解不明显甚至病情加重则判定为无效[7]。

3.BALF采集和指标测定 (1)BAL及BALF的收集 所有患者第1 d行纤维支气管镜检查；在治疗的第4、7 d经纤维支气管(南京恒腾电子科技有限公司)进行BAL；选择右肺中叶或左上叶舌段，注入0.9%氯化钠液之后，使用合适的负压(100 mmHg，1mmHg=0.133 kPa)吸取BALF，其中总回收率需≥30%[6]。

(2)RNA 的提取、 标记与芯片杂交 采用 TRIzol法提取 BALF 中 RNA， 并进行纯化，应用分光光度仪(美国NanoDrop®公司 型号：ND-1000)测定 BALF 中的 RNA 浓度，采用电泳法检测 BALF 中 RNA 的完整性；BALF中的RNA标记和杂交根据德国QIAGEN公司提供的方法进行，所有操作由专业人员严格按照产品说明书进行操作。应用聚合酶链式反应(PCR)法动态检测第1、4、7天的miR-127-5p 表达量，每次试验重复3次， 用 2-Δ Δ CT 表示。

(3)IL-6、IL-8及IL-10炎症因子测定 采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法(美国R&D Systems)对BALF 中IL-6、IL-8及IL-10水平进行测定，所有操作由专业人员严格按照产品说明书进行操作。

4.统计学分析 采用SPSS22.0统计学软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差表示，采用t检验；非正态分布资料采用中位数(M)及四分位数间距(P25，P75)表示，用秩和检验。计数资料采用频数(率)表示，采用χ2检验；绘制受试者工作特征曲线(ROC)分析 BALF 中 miR-127-5p 表达量对重症肺炎的诊断价值。以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.两组基线资料对比 预后良好组和预后不良组比较年龄等基线资料，差异无统计学意义(P>0.05)，两组具有可比性，见表1。

表1 两组患者的基线资料对比

表2 两组 miRNA-127-5p表达量及IL-6、IL-8及IL-10水平比较s，M(QR)]

表3 各参数的ROC曲线分析结果

2. 两组miRNA-127-5p表达量以及IL-6、IL-8及IL-10水平 动态监测两组患者BALF中的miRNA-127-5p表达量以及IL-6、IL-8及IL-10水平；治疗第4天，预后良好组的miRNA-127-5p表达量显著高于预后不良组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗第4天，预后良好组的IL-8，IL-10水平显著低于预后不良组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗第7天，预后良好组的miRNA-127-5p表达量显著高于预后不良组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗第7天，预后良好组的IL-8，IL-10水平显著低于预后不良，差异有统计学意义(P<0.05)；经治疗，两组的miRNA-127-5p表达量逐渐升高，IL-8，IL-10水平逐渐降低，见表2。

3. ROC曲线分析重症肺炎患者预后相关性 ROC曲线分析治疗4 d时miRNA-127-5p表达量、IL-8和IL-10水平的曲线面积分别为0.805，0.564，0.598。治疗7 d时的miRNA-127-5p表达量、IL-8和IL-10水平的曲线面积分别为，0.825，0.624，0.667。各参数指标特异度灵敏度(见表3)，其中治疗4 d和7d时的miRNA-127-5p表达量重症肺炎患者预后情况的相关性较好，曲线下面积分别为0.805和0.825，远高于其他指标的曲线下面积(表3)。

图1 各参数的ROC曲线分析结果

讨 论

重症肺部感染，一般认为是严重的肺部感染伴有严重的中毒症状或出现严重并发症，常分为重症医院获得性肺炎(hospital-acquired pneumonia, HAP)和重症社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia, CAP)[8]。患者常伴呼吸困难、持续性高热等，病情发展迅速，多累及多个脏器，可导致多器官衰竭(multiple organ failure, MOF)，其中HAP病死率为15.5%～38.2%[5]，CAP病死率为20%～30%[4]。肺泡灌洗，全称为纤维支气管肺泡灌洗，是指通过纤维支气管镜注入0.9%氯化钠液并进行抽吸，清除充填于肺泡内的物质，并收集BALF，进行炎症、免疫细胞、可溶性物质、癌症细胞等相关检查，探讨病因和发病机制[6,9-10]。临床医生对重症肺炎进展认识较浅，而且目前存在有各种样的炎症辅助诊断指标，对重症肺炎的诊断及进程评估有较大的障碍，故寻找指征指标是重症肺炎的诊疗关键。近年来，miRNA已经在心血管、自身免疫等多个领域指导疾病的诊疗，

miRNA在真核基因表达调控中有着广泛的作用，而其主要是与信使RNA的3’非翻译区结合，进而抑制翻译进程和(或)信使RNA的降解，最后抑制了蛋白质的合成，达到基因调控的最终目的[2]。miRNA可以负性调节基因的表达，能够参与调控其靶信使RNA的稳定性以及翻译效率，对人体的免疫调节，B、T淋巴细胞、单核细胞以及嗜中性粒细胞的发育、分化、增殖，包括抗体的产生都有影响。过去有报道[11～15]miRNA对于心肌损伤、脓毒症与全身炎症反应的诊断十分关键。其中miRNA通过参与调节Toll样受体(Toll-like receptors, TLR)以及细胞因子的应答来介入人体先天免疫应答与调节，这能够在大幅度提升免疫力并且增强机体的抵抗能力[16]。

通过本项研究结果得知，治疗4 d、7d后，预后不良组的miRNA-127-5p表达量为0.571±0.412，显著低于预后良好组(P<0.05)，其中预后不良组经治疗后炎性因子IL-8和IL-10高于预后良好组，并且维持在相对较高的水平。笔者认为预后不良主要原因是miRNA-127-5p参与了重症肺炎中的免疫感染过程，预后不良组患者体内的miRNA-127-5p水平没有得到恢复，可能是miRNA-127-5p呈低表达时，无法通过Toll样受体调控炎症反应，致使患者机体的IL-8、IL-10等炎性因子得不到有效的抑制，而炎症因子的持续释放，会使机体的免疫系统难以抑制重症肺炎中“瀑布式”的炎症反应，使得炎性因子进一步加重患者的肺部病情，甚至触发MOF，最终导致患者预后不良甚至产生更为严重的后果。研究结果显示miRNA-127-5p表达量在预测重症肺炎患者预后具有不错的效能，为重症肺炎的临床诊疗提供了新的思路。

综上认为，肺泡灌洗液中miRNA-127-5p表达量有望成为一种判断重症肺炎患者的预后的新型生物标志物。但是本研究属于回顾性研究且时间跨度不大，纳入样本数较少，仍需在多中心联合下采用更大样本、前瞻性随机对照研究来进一步证实。