微小核糖核酸作为急性脑梗死诊断标志物的Meta分析

张 婷 曹文斋 罗 斌 钟 森

脑梗死在全世界范围内，是导致患者致死、致残的主要原因之一。在美国，每年发病人数超过790 000例，平均每4分钟即有一人死于脑卒中[1]。脑梗死的死亡率目前在西方世界已出现下降的趋势，可能是由于脑梗死的早期诊断，及时给予溶栓或介入治疗，减少了患者致死、致残率。脑梗死的诊断主要依赖于影像学检查，CT对于缺血性梗死超早期的脑梗死价值有限，MRI由于检查时间长，限制了在脑梗死早期诊断的应用。因此，发现脑梗死早期诊断的标志物，对于进一步降低患者死亡率极为重要。近年来研究表明，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)可能是一个很有潜在价值的生化标志物[2]，其可稳定表达于血液中，并呈现组织特异性。miRNA在神经系统的正常发育和病理过程中亦发挥重要的调节作用[3]。在既往关于急性脑梗死的研究中发现[4-6]，在患者血液中能检测到异常表达的miRNA，提示miRNA可能是急性脑梗死发病时的标志物。但是这些研究普遍存在样本量较小、受试对象不同、检测技术的系统误差，导致各研究结果间存在较大差异的问题，不能得出肯定的结果。本文通过Meta分析，对miRNA在急性脑梗死中的诊断效能进行系统评估，以期为临床实践和应用提供参考。

资料与方法

1.文献检索策略 应用计算机检索Medline、PubMed、Embase、Cochrane Library Database、万方数据库、中国学术期刊网全文数据库(CNKI)和维普数据库(VIP)，检索语种为中文和英文。主要的中英文检索词为脑梗死(cerebral infarction、brain infarction)、脑缺血(cerebral ischemia、brain ischemia)、微小RNA(microRNA、miRNA)、中风(stroke)。通过阅读题目及摘要，筛选纳入研究的中英文文献。以PubMed为例，具体检索策略见如下：Search ((((((brain infarction[MeSH Major Topic]) OR cerebral ischemia[MeSH Major Topic]) OR stroke[MeSH Major Topic])) OR ((cerebral ischemia[Title/Abstract]) OR brain ischemia[Title/Abstract]))) AND ((MicroRNA[MeSH Major Topic]) OR miRNA[Title/Abstract])。检索时限均为建库至2018年12月，并追溯纳入文献的参考文献。

2.文献的纳入级排除标准 (1)纳入标准：①评价miRNA在脑梗死诊断中的价值的文献；②脑梗死的诊断以影像学(CT/MRI)为金标准；③研究提供足够的数据满足 2 × 2 四格表的构建；④研究类型包括队列研究和病例对照研究；⑤研究中每组病例数≥4。

(2)排除标准：①非人体试验；②无对照组的试验；③综述、会议摘要；④不能提供完整数据的文献；⑤重复发表的文献

3.文献资料的筛选、提取及评价 (1)文献的筛选及提取 由2名研究者共同制定文献的筛选标准，分别筛选、阅读原始文献标题、摘要，在排除明显不符合纳入标准的文献后对可能符合纳入标准的文献认真阅读全文，以确定是否真正符合纳入标准，最后2名研究者交叉核对文献，如遇分歧可由第三者决定是否纳入研究。提取内容包括：①纳入研究的基本信息：研究文献题目、第一作者、发表年限等；②纳入研究的基线特征：研究人群及地区、研究对象的例数、检测方法及手段等；③诊断性试验的相关指标：灵敏度(SEN)及特异度(SPE)、或者真阳性值(true positive, TP)、假阳性值(false negative, FN)、真阴性值(true negative, TN)、假阴性值(false negative, FN)；④偏倚风险评价关键要素。

(2)质量评价 采用质量评价工具(quality assessment of diagnostic accuracy studies,QUADAS)标准[7]进行文献质量评定，包括14个条目：疾病谱组成、选择标准、金标准、疾病进展偏倚、部分参照偏倚、多重参照偏倚、混合偏倚、待评价试验的实施、金标准的实施、试验解读偏倚、金标准解读偏倚、临床解读偏倚、难以解释的试验结果和退出病例。评分细则为：若认为所选择研究符合条目，则评价为“是”。若所选研究的选择标准没有明确报告，那么应评价为“否”。若研究仅报告了部分选择标准，并且现有信息不足以将该条目评价为“是”，则应评价为“不清楚”。每一条目评价结果为“是”的记为1分，总分14分。

4.统计学方法 该研究采用Stata 14和Meta-Disc 1.4对纳入文献进行统计学分析。选取灵敏度、特异度、阳性似然比、阴性似然比和ROC效应指标进行该诊断试验的Meta分析。采用Q统计量和I2检验评估异质性，如果P<0.05(Q统计)或I2>50%，则采用随机效应模型计算合并效应量，否则采用固定效应模型。对于发表偏倚，采用Deek’s检验来评估纳入的研究。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.纳入研究的基本情况 初检共获得相关文献982篇，经过逐层筛选，最终纳入的19篇文献[4-6，8-23]，筛选流程图见图1。纳入文献包含26组miRNA，研究组和对照组共2580例，其中病例组1543例，对照组1037例。所有的患者都根据临床症状结合影像学CT/MRI诊断为脑梗死，对照组为多数为健康的志愿者或体检者。研究涉及24种miRNA的亚型。其中研究有17个在中国进行，1个在德国，1个在美国。所有研究采用qRT-PCR方法检测miRNA表达水平。提取的相关信息参见表1。

表 1 纳入 Meta 分析研究的文献基本信息

图1 文献筛选的流程图

2.纳入研究的方法学质量评价 利用QUADAS对19篇研究做出评价，文献评价得分中位数： 11分，纳入所有研究文献评分均≥10分，文献整体质量较好。

3.异质性分析和阈值效应 采用Spearman检验计算真阳性率的对数值与假阳性率的对数值之间的相关系数和P值来排除阈值效应。Spearman 相关系数为-0.030，P=0.881，提示不存在阈值效应。诊断比值比的Cochran-Q值为132.17，I2值为80.3%，P<0.1，表明研究间存在异质性，可能与对照人群、试验方法等有关。因此，在该Meta分析中应用DerSimonian-Laird法。

图2 miRNA在急性脑梗死中的敏感度

图3 miRNA在急性脑梗死中的特异度

图4 miRNA在急性脑梗死中的阳性似然比

图5 miRNA在急性脑梗死中的阴性似然比

图6 miRNA在急性脑梗死中的诊断比值比

4.诊断价值评价 从合并的数据所做的森林图看，异质性较为明显(I2>70%，P<0.1)，因此，采用随机效应模型用于评价miRNA在急性脑梗死中的诊断价值。整体miRNA诊断急性脑梗死的灵敏度为0.82(95%CI：0.80～0.83，图2)，特异度为0.81(95%CI：0.79～0.83，图3)，阳性似然比为5.19(95%CI：3.61～7.47，图4)，阴性似然比是0.24(95%CI：0.20～0.30，图5)，诊断比值比为24.01(95%CI：14.92～38.64，图6)。SROC曲线的AUC为0.89，SROC 曲线显示Q 值为0.82(图7)。上述结果表明，miRNA对急性脑梗死具有较好的诊断价值。然而，由非阈值引起的异质性能够在诊断指标的森林图中清晰地观察到，笔者试图利用meta回归(如种族人群、对照选择和样本来源等)来探索研究的特点。 因为在纳入的研究中，miRNA均取采用qRT-PCR进行检测，因此，检测方法不是异质性的来源。采用种族人群、对照选择、样本来源和miRNA类型进行meta回归(P>0.05)，表明未找到异质性的来源(表2)。研究采用Fagan列线图描述miRNA对急性脑梗死的诊断效果(图8)。结果表明，临床检测使用miRNA，检测结果为阳性时，患者被诊断为急性脑梗死的概率由验前概率20%上升至验后概率59%，然而检测结果阴性时，检测者被诊断为非脑梗死患者的概率由验前概率20%下降至验后概率5%。由此可见，使用miRNA诊断脑梗死的精确性显著提高。

图7 miRNA在急性脑梗死中的SROC曲线

5.发表偏倚 发表偏倚被认为是影响诊断准确性的又一因素。采用Deek’s检验用于评估纳入文献是否存在发表偏倚。纳入19篇研究基本均匀分布在回归线两侧。Deek’s检验的P=0.18，提示无明显的发表偏移(图9)。

图8 miRNA诊断急性脑梗死的Fagan列线图

图9 采用Deek’s法检验纳入研究的发表偏倚

表2 Meta回归检测异质性的潜在来源

讨 论

目前，脑血管造影是诊断脑血管疾病的金标准，但是由于其有创性及花费时间长，不利于在急性脑梗死中应用。目前2018年美国心脏学会及卒中学会(AHA/ASA)[24]仍然推荐常规CT或MRI作为急性脑梗死的影像学检查。然而，对于超急性期和急性期脑梗死，常规头颅CT 很难发现缺血灶。且重症患者行CT和MRI检查存在转运不便，过程中风险较大的问题，有些医疗机构不能提供及时的头颅CT或MRI检查，这些都限制了急性脑梗死的早期诊断。Chernyshev等[25]所做的研究发现，目前的急性脑梗死的诊断方法导致21%的非脑梗死患者错误接受了rt-PA的溶栓治疗。因此，很多研究试图发现更好的针对急性脑梗死的诊断方法。Brunser等[26]对DWI用于急性缺血性脑卒的诊断价值进行研究，发现DWI诊断脑梗死的灵敏度为87.3%，特异度为99%。但是由于MRI花费时间长，限制了其应用。某些血清生物标志物(包括S100 蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的变化可以反映急性脑梗死的严重程度、发展和转归。然而，这类蛋白质生物标记物由于组成复杂，且易受环境影响降解、变性，缺乏特异性[27-29]。所以，其在临床应用亦存在局限性。

miRNA是一类小子非编码RNA，它调节广泛基因的表达，并在各种生物功能中发挥重要作用。miRNA与脑梗死的相关证据主要来源于动物模型中调控机制研究及临床研究中的表达差异[23, 30]，提示miRNA可能成为急性脑梗死的新型生物学标志物和治疗靶点，但是由于缺乏大量的临床研究样本，其诊断效果仍不明确。本研究发现在急性脑梗死患者和对照人群血液中整体miRNA的表达水平不一致，差异有统计学意义。通过筛选，共纳入19篇文章，2 580例研究对象。结果显示：采用miRNA诊断急性脑梗死的SEN为0.82，SPE为0.81，说明漏诊率为18%，误诊率19%。PLR为5.19，提示急性脑梗死患者miRNA检测阳性的概率比正常人群检测阳性的概率高5.19倍。NLR为0.24，提示miRNA检测结果为阴性的人群中，24%的人有可能是患有急性脑梗死的，因而不能完全排除急性脑梗死。DOR值为24.01，提示miRNA具有较高的鉴别急性脑梗死的能力。AUC值为0.89，表明其诊断效能较高。本研究结果显示在诊断人群中，miRNA的SEN变化范围不大(0.80 ～0.83)，提示该诊断稳定性较好，又因miRNA检查方便快捷，所以miRNA是诊断急性脑梗死较好的手段。

本研究不足之处在于:首先miRNA检验急性脑梗死的研究近年来才刚刚起步，相关报道较少，虽然尽可能采取多种途径广泛收集国内外文献，但由于本文只检索了中、英文文献，所以部分国家及地区的文献不能纳入，可能造成了一些文献的缺失。此外，本研究的对照人群，多数为健康对照，可能与现实世界中的急性脑梗死的相似人群有差异，因此在应用本研究的结论时需要特别注意。另外，不同的研究中，样本处理及储存的时间、方式的不同，诊断试验所用试剂和仪器的不同，实验者的不同及脑梗死患者梗死部位及严重程度的不同，都使各研究存在一定的异质性，影响了Meta分析结果的准确性。在今后的诊断性试验研究中，应明确应明确研究对象的选择标准，还应保证试验过程中的盲法。

综上所述，miRNA检测对急性脑梗死有较好的预测作用。但受纳入研究数量和质量的限制，上述结论尚待更多高质量研究予以验证。