瑞芬太尼调控miR-148a对骨肉瘤细胞生物行为的影响

孟杨，王绍伟，王宪峰，徐海伟

骨肉瘤是临床常见恶性肿瘤之一，常发病于青少年时期，其病死率较高，目前临床主要采用外科手术与化疗等方式治疗骨肉瘤，但治疗效果不佳[1]。由于骨肉瘤具有高度特异性导致其极易产生耐药性从而影响治疗效果[2-3]。因而寻找新型安全有效的药物是临床治疗骨肉瘤亟待解决的关键问题。研究表明瑞芬太尼可抑制肝癌、肺癌等多种肿瘤细胞增殖，并可降低细胞迁移侵袭能力[4-5]。但瑞芬太尼对骨肉瘤细胞生物行为的影响及其机制尚未见报道。研究表明微小RNA-148a(microRNA-148a，miR-148a)在骨肉瘤患者中表达下调，其可作为骨肉瘤早期诊断及评估患者预后的生物标志物[6]。过表达miR-148a可抑制骨肉瘤细胞增殖，抑制miR-148a表达可促进骨肉瘤细胞增殖[7]。因此，本研究主要探讨瑞芬太尼对骨肉瘤细胞增殖、凋亡的影响，初步分析其对miR-148a表达的调控作用，为临床合理应用瑞芬太尼治疗骨肉瘤提供理论依据，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)骨肉瘤细胞MG63：购自中国科学院上海细胞库，DMEM培养基购自美国Thermo Fisher公司；胎牛血清与胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；(2)试药与试剂：瑞芬太尼购自湖北宜昌人福药业有限责任公司。miR-148a抑制剂(anti-miR-148a)、anti-miR-NC购自广州锐博生物科技有限公司；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；MTT细胞增殖检测试剂盒购自黄石研科生物科技有限公司；Annexin V-FITC / PI双染法细胞凋亡检测试剂盒购自上海钰博生物科技有限公司；Total RNA Kit试剂盒购自美国Omega Biotech公司；M-MLV第一链试剂盒购自美国Life Technologies公司；SYBR Green qPCR Super Mix-UDG试剂盒购自美国Life Technologies公司；RIPA裂解液购自美国Cell Signaling Technology公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；ECL试剂盒购自美国Pierce公司；兔抗人细胞周期蛋白1(CyclinD1)、P21一抗购自美国Santa Cruz公司；兔抗人B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 骨肉瘤标本 收集2017年3月—2018年5月山东省枣庄矿业集团枣庄医院骨科收治骨肉瘤患者36例为研究对象，均接受手术治疗，切除骨肉瘤组织经病理证实为骨肉瘤、癌旁组织，二者放入液氮中，术后转移至-80 ℃超低温冰箱内保存。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者知情同意且签署同意书。

1.3 实验方法 2017年8月—2018年12月于山东省枣庄矿业集团枣庄医院实验室进行实验。 (1)瑞芬太尼1 mg溶解于0.9%氯化钠注射液1 ml中，过滤，用DMEM培养基将原液分为不同浓度的干预液(0.1、1、10、100、200 μmol/L)。培养MG63细胞，培养条件为37℃、5%CO2饱和湿度培养箱，培养液为DMEM培养基(含有10%胎牛血清与青霉素—链霉素混合溶液)，待细胞融合度为90%时进行传代培养，选取对数生长期细胞进行实验研究，用终浓度为0.1、1、10、100、200 μmol/L的瑞芬太尼处理MG63细胞，分别为瑞芬太尼0.1 μmol/L组、1 μmol/L组、10 μmol/L组、100 μmol/L组、200 μmol/L组，未经任何处理的细胞作为对照组，应用MTT法检测细胞增殖抑制情况。(2)选用抑制率约为50% 瑞芬太尼浓度用于后续研究，将MG63细胞随机分为瑞芬太尼10 μmol/L+anti-miR-NC亚组(anti-miR-NC转染入MG63细胞，用终浓度为10 μmol/L的瑞芬太尼处理MG63细胞)、瑞芬太尼10 μmol/L+anti-miR-148a亚组(anti-miR-148a转染入MG63细胞，用终浓度为10 μmol/L的瑞芬太尼处理MG63细胞)，各亚组处理时间均为48 h，收取对数生长期细胞进行后续研究。

1.4 观测指标与方法

1.4.1 MTT检测细胞增殖：取对数生长期MG63细胞，0.25%胰蛋白酶消化细胞，用DMEM培养液(含有10%胎牛血清)制备单细胞悬液接种于96孔板(3×104个细胞/孔)，培养24 h后，按不同分组分别于24 h、48 h、72 h时每孔加入MTT溶液20 μl(5 mg/ml)，室温孵育4 h，弃上清，加入DMSO(150 μl/孔)，匀速振荡10 min，应用酶标仪检测各孔吸光度值(OD 490 nm)。实验重复3次，取平均值。

1.4.2 流式细胞术检测细胞凋亡：取各组MG63细胞，预冷PBS洗涤2次，每次10 min，细胞沉淀转移至流式检测管，加入1×binding buffer重悬细胞500 μl，依次加入Annexin V-FITC、PI各5 μl，充分混匀，室温条件下暗室避光孵育10 min，于1 h内上机，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.4.3 qRT-PCR法检测RNA表达：应用Total RNA Kit试剂盒提取骨肉瘤组织、癌旁组织细胞总RNA，应用NanoDrop检测RNA浓度与纯度，应用反转录试剂盒合成cDNA，参照SYBR Green qPCR Super Mix-UDG试剂盒配置qRT-PCR反应体系，qRT-PCR反应条件：95℃ 10 s(循环1次)，95℃ 10 s，60℃ 60 s(循环40次)。应用ABI 7500实时PCR进行检测，采用2-ΔΔCt法计算miR-148a的相对表达量，miR-148a以U6为内参，miR-148a正向引物为5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’，反向引物为5’-GCGTCAGTGCACTACAGAACTT-3’；U6正向引物为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物为5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.4.4 蛋白免疫印迹(Western blot)检测Cyclin D1、P21、Bax、Bcl-2蛋白表达：收集各组MG63细胞，加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度，采用SDS-PAGE电泳分离蛋白，蛋白上样量30 μg/孔，电泳结束后转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗(1∶1 000)，摇床上4℃孵育过夜，TBST洗涤3次×10 min，加入相应二抗(1∶2 000)，室温条件下摇床匀速孵育1 h，TBST洗涤2次×10 min，曝光，显影，应用Image J软件分析各条带灰度值。

2 结 果

2.1 各组MG63细胞增殖比较 与对照组比较，瑞芬太尼0.1 μmol/L组、瑞芬太尼1 μmol/L组、瑞芬太尼10 μmol/L组、瑞芬太尼100 μmol/L组、瑞芬太尼200 μmol/L组MG63细胞OD值显著降低(P<0.01)；Cyclin D1蛋白的表达水平显著降低(P<0.01)，P21蛋白的表达水平显著升高(P<0.01)，瑞芬太尼不同剂量组间比较差异均有统计学意义(P<0.01)，呈剂量依赖效应，其中选用抑制率约为50%瑞芬太尼浓度做后续实验，见图1、表1。

2.2 各组MG63细胞凋亡率比较 与对照组比较，瑞芬太尼0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L组MG63细胞凋亡率显著升高(P<0.01)，Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白的表达水平显著降低(P<0.01)，见图2、表2。

注：1.对照组；2.瑞芬太尼0.1 μmol/L组；3.瑞芬太尼1 μmol/L组；4.瑞芬太尼10 μmol/L组；5.瑞芬太尼100 μmol/L组；6.瑞芬太尼200 μmol/L组

图1 不同浓度的瑞芬太尼对MG63细胞增殖蛋白表达的影响

注：1.对照组；2.瑞芬太尼0.1 μmol/L组；3.瑞芬太尼1 μmol/L组；4.瑞芬太尼10 μmol/L组；5.瑞芬太尼100 μmol/L组；6.瑞芬太尼200 μmol/L组

图2 瑞芬太尼对MG63细胞凋亡蛋白表达的影响

表2 瑞芬太尼对MG63细胞凋亡的影响

表1 瑞芬太尼对MG63细胞增殖的影响

2.3 miR-148a在骨肉瘤中的表达及瑞芬太尼对MG63细胞中miR-148a表达的影响 与癌旁组织比较，骨肉瘤组织中miR-148a的表达水平显著降低(1.02±0.10 vs. 0.31±0.03,t/P=20.402/<0.001)；与对照组比较，瑞芬太尼10 μmol/L组MG63细胞中miR-148a的表达水平显著升高(0.22±0.02 vs. 0.68±0.07,t/P=18.956/<0.001)。

桑：在盖博牺牲之后，浮西努曾用很长时间来思考感情的问题。在她这个年纪，正是见解成熟，思力旺盛的时期，并且能够很好地处理一些情感上的问题，准确些说，可以更合理地把自己从种种困惑中解脱出来。只能说即使是若干世纪之后，时间还是这样不紧不慢，天气仍是诡谲神秘，一定仍会有人像自己，像是轮回转世一样，仿佛自己又复生了一般。对于为盖博殉情的苏珊娜，浮西努最终选择了原谅，并把她的遗物与盖博合葬在德克萨斯。

2.4 抑制miR-148a对瑞芬太尼抑制MG63细胞增殖的影响 与瑞芬太尼10 μmol/L+anti-miR-NC亚组比较，瑞芬太尼10 μmol/L+anti-miR-148a亚组MG63细胞增殖活力显著升高，Cyclin D1蛋白的表达水平显著升高，P21蛋白的表达水平显著降低(P<0.01)，见图3、表3。

注：1.对照组；2.瑞芬太尼10 μmol/L组；3.瑞芬太尼10 μmol/L+anti-miR-NC亚组;4.瑞芬太尼10 μmol/L+anti-miR-148a亚组

图3 抑制miR-148a对瑞芬太尼抑制MG63细胞增殖蛋白表达的影响

2.5 抑制miR-148a对瑞芬太尼促进MG63细胞凋亡的影响 与瑞芬太尼10 μmol/L+anti-miR-NC亚组比较，瑞芬太尼10 μmol/L+anti-miR-148a亚组MG63细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，见图4、表4。

注：1.对照组；2.瑞芬太尼10 μmol/L组；3.瑞芬太尼10 μmol/L+anti-miR-NC亚组;4.瑞芬太尼10 μmol/L+anti-miR-148a亚组

图4 抑制miR-148a对瑞芬太尼促进MG63细胞凋亡蛋白表达的影响

3 讨 论

骨肉瘤是指间质细胞从软骨阶段发展形成肿瘤骨样组织，早期诊断及治疗可有效提高骨肉瘤患者的生存率[8]。近年来，研究表明1种或2种药物联合应用具有协同抗肿瘤的作用[9-10]。因此，本研究观察瑞芬太尼对骨肉瘤的抗肿瘤作用，初步探讨其作用机制，旨在为该药物的临床应用提供理论基础。

瑞芬太尼可抑制肺癌手术患者血清IL-6水平而抑制氧化应激反应[11]。研究表明瑞芬太尼可能通过下调IL-7R表达而抑制肺腺癌细胞转移[12]。瑞芬太尼可能通过抑制Akt通路而抑制胰腺癌细胞增殖并诱导细胞凋亡[13]。瑞芬太尼属于μ受体激动剂，研究指出瑞芬太尼可抑制结肠癌细胞增殖并促进细胞凋亡[14]。本结果显示，不同浓度的瑞芬太尼处理骨肉瘤MG63细胞后，细胞增殖活力显著降低，细胞凋亡率显著升高，与上述报道相似，提示瑞芬太尼可抑制骨肉瘤细胞增殖并促进其凋亡；同时显示瑞芬太尼可显著提高MG63细胞中P21的表达水平，降低Cyclin D1的表达水平，与相关文献报道结果一致[15]。提示瑞芬太尼可能通过上调P21的表达及下调Cyclin D1的表达进而抑制骨肉瘤细胞增殖。而瑞芬太尼处理后MG63细胞中Bax蛋白水平显著升高，Bcl-2蛋白水平显著降低，与相关报道相似[16]。提示瑞芬太尼可能通过上调Bax表达及下调Bcl-2表达而促进骨肉瘤细胞凋亡。

表3 抑制miR-148a对瑞芬太尼抑制MG63细胞增殖的影响

表4 抑制miR-148a对瑞芬太尼促进MG63细胞凋亡的影响

miR-148a在鼻咽癌、胃癌组织或细胞中表达水平降低，上调miR-148a表达可抑制癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。研究表明miR-148a还可抑制胃癌细胞迁移及侵袭[17-18]。相关研究报道指出miR-148a过表达可通过抑制靶基因HPIP表达而抑制非小细胞肺癌细胞增殖[19]。本结果显示，瑞芬太尼处理后MG63细胞中miR-148a的表达水平显著升高，提示瑞芬太尼可能通过上调miR-148a表达而影响骨肉瘤细胞增殖及凋亡。进一步研究显示抑制miR-148a可逆转瑞芬太尼对MG63细胞增殖的抑制作用，还可逆转瑞芬太尼对MG63细胞凋亡的促进作用。本实验结果证实，瑞芬太尼可通过促进miR-148a表达而降低骨肉瘤细胞增殖能力，促进细胞凋亡。

综上所述，瑞芬太尼对骨肉瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用，并可诱导细胞凋亡，其可能通过上调miR-148a表达而发挥作用，为瑞芬太尼临床应用于骨肉瘤的治疗奠定理论基础。但关于瑞芬太尼在动物体内的相关实验及其安全性研究均需进一步探讨。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

孟杨、王宪峰：论文撰写，进行统计学分析，论文修改；王绍伟、徐海伟：实施研究过程，数据收集，分析整理