白血病患者ID4、hMLH1、CDX2基因启动子区异常甲基化及mRNA表达分析

韩松，侯志新，刘承祥，张雷，郑伟

DNA甲基化是指在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现的一种DNA化学修饰形式。DNA结合抑制因子4(DNA binding inhibitor 4, ID4)是一种新的抑癌因子，可调节细胞分化，在细胞繁殖前后和细胞周期发展中起作用。有研究表明，骨髓增生异常综合征患者ID4基因甲基化与恶性肿瘤复发及转移有关[1]。人类Mut L同源物1(human Mut L homolog 1, hMLH1)是DNA错配修复系统(mismatch repair system, MMR)中的重要基因，hMLH1基因启动子区异常甲基化可导致MMR失活，且hMLH1基因mRNA的表达及功能缺失与多种肿瘤的发生发展有关。尾型同源盒转录因子2(caudal-type homeobox transcription factor 2,CDX2)是一种转录因子，CDX2基因mRNA表达的失调与肿瘤的发生发展密切相关，在膀胱癌中CDX2基因mRNA呈高表达[2-3]。为研究ID4、hMLH1、CDX2表达是否受到基因启动子区甲基化影响，本研究分析白血病患者ID4、hMLH1、CDX2基因启动子区异常甲基化及mRNA表达情况，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年1月—2019年3月中国人民解放军联勤保障部队第九六四医院确诊的白血病患者90例作为研究组，按照白血病类型分为急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)38例，慢性粒细胞白血病(chronic myelocytic leukemia, CML)24例，急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)28例； AML男27例，女11例；年龄16～52(35.17±11.25)岁。CML男16例，女8例；年龄17～48(33.35±11.27)岁。ALL男20例，女8例；年龄20～50(34.73±10.83)岁。选取同期健康志愿者30例作为健康对照组，男20例，女10例；年龄22～49(34.39±9.54)岁。2组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，受试者及家属知情同意并签署同意书。

1.2 选择标准 (1)纳入标准：①经临床确诊为白血病，且均符合法、美、英分型系统(French-American-British classification systems)[4]的诊断和分型标准；②年龄16～52岁。(2)排除标准：①严重肝、肾功能不全者；②其他严重恶性肿瘤影响本研究者。

1.3 试验方法 收集受试者抗凝骨髓液2～5 ml，采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，保存于-80℃进行基因组提取。

1.3.1 ID4、hMLH1、CDX2基因启动子区甲基化检测： 取1×106个单个核细胞提取总RNA，采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reaction, MS-PCR)检测 ，DNA/RNA抽提试剂盒、PCR引物购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。(1)ID4反应条件，94℃ 4 min，94℃ 30 s，45℃ 30 s，72℃ 30 s ，此为1个循环，共进行30个循环，再在72℃条件下进行7 min的延展。ID4甲基化特异性上游引物为5'-TTTTATAAATATAGTTGCGCGGC-3'，下游引物为5'-GAATATCCTAATCACTC-CCTTCGA-3'。(2)hMLH1反应条件，94℃ 4 min，94℃ 45 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，此为1个循环，共进行40个循环，再在72℃条件下进行7 min的延展。hMLH1甲基化特异性上游引物为5'-ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC-3'，下游引物为5 '-CCTCATCGTAACTACCCGCG-3'。(3)CDX2反应条件，94℃ 5 min，94℃ 30 s，45℃ 30 s，72℃ 45 s，此为1个循环，共进行30个循环，再在72℃条件下进行7 min的延展。CDX2甲基化特异性上游引物为5'-CGAAAATAAAAATCACTACGACG-3'、下游引物为5'-ATTCAAAAATAAAAATCACTACAACA-3'。

1.3.2 ID4、hMLH1、CDX2基因mRNA表达水平检测： 采用逆转录—聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测，人CML细胞株K562、AML细胞株HL-60购自上海继和生物科技有限公司，RT逆转录试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。①ID4反应条件，94℃ 4 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，此为1个循环，共进行40个循环，再在72℃条件下进行7 min的延展。ID4上游引物为5'-TCACTGCGCTCAACACCGACCC-3'，下游引物为5'-TTCCCCCTCCCTCTCTAGTGCTCCTG-3'。②hMLH1反应条件，94℃ 4 min，94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，此为1个循环，共进行30个循环，再在72℃条件下进行7 min的延展。hMLH1上游引物为5'-CGGTTACTACCCAATGCCTCAACG-3'，下游引物为5'-TTCTCGACTAACAGCATTTCCAA-3'。③CDX2反应条件，94℃ 5 min，94℃ 30 s，49℃ 30 s，72℃ 45 s，此为1个循环，共进行30个循环，再在72℃条件下进行8 min的延展。CDX2上游引物为5'-AAAGGATATTGGAGAGTATTTTAG-3'，下游引物为5'-CATAGTCCTGGATTTCGTCA-3'。

2 结 果

2.1 2组ID4、hMLH1、CDX2基因启动子区异常甲基化比较 AML、CML、ALL患者的ID4 、hMLH1基因甲基化发生率均高于健康对照组(P<0.01)，而CDX2基因甲基化与健康对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 2组受试者ID4、hMLH1、CDX2基因启动子区异常甲基化比较 [例(%)]

2.2 2组ID4、hMLH1、CDX2基因mRNA表达比较 与健康对照组比较，AML、CML、ALL患者的ID4、hMLH1基因mRNA表达较低，而CDX2基因mRNA表达较高，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 2组受试者ID4、hMLH1、CDX2基因mRNA表达比较

3 讨 论

白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病，其发生与表观遗传和细胞遗传的改变有关。文献研究表明，肿瘤的发生发展与表观遗传中的CpG岛甲基化异常有关[5-7]。DNA甲基化是DNA的天然修饰方式，其过程为DNA甲基转移酶催化甲基供体，使胞嘧啶转变为5甲基胞嘧啶，可参与基因的调控、表达及细胞的增生、调节和分化。吴明彩等[8]研究表明，染色质域解旋酶DNA结合蛋白5(chromodomain helicase DNA binding protein 5,CHD5)基因异常甲基化影响其表达，可促进AML的发生。本研究采用MS-PCR、RT-PCR对AML、CML、ALL患者及健康志愿者的ID4、hMLH1、CDX2基因启动子区异常甲基化及mRNA表达进行分析，旨在研究白血病的分子发病机制，为白血病的防治提供辅助参考。

ID4基因位于染色体6p22.3-p23区域，是白血病的抑癌基因。ID4基因由于缺乏富含碱性氨基酸的DNA结合域，因此其Id蛋白不能够与DNA结合，但可与碱性HLH蛋白(basic helix-loop-helix, bHLH)结合，从而抑制bHLH与DNA结合，调控相关基因转录[9-10]。有研究表明，ID4基因与肿瘤侵袭、肿瘤血管形成有关，在白血病中呈高度甲基化[11]。本研究结果显示，AML、CML、ALL患者的ID4基因甲基化异常升高；AML、CML、ALL患者的ID4基因mRNA表达异常降低。结果证明ID4基因的异常甲基化在白血病的发生中起着重要作用，可影响ID4基因mRNA表达，并作为疾病诊断和预后评估的辅助方法。刘菲等[12]研究表明，在AML患者中ID4基因呈高频甲基化，发生率约为80%，在健康人体中未发现ID4基因异常甲基化。崔桂荣等[13]研究表明，AML、CML、ALL患者ID4基因异常甲基化分别为73.5%、76.2%、84.0%，健康对照组为3.3%，且AML、CML、ALL患者的ID4基因mRNA表达均明显低于健康对照组，与本研究结果相吻合。

hMLH1基因位于染色体3p21-23区域，是MMR系统的关键基因，是最早发现的错配修复基因之一，可识别碱基错配部分，启动错配修复途径，其启动子区异常甲基化可影响基因的表达及功能。多数研究证实，在血液系统肿瘤、实体性肿瘤中会发生hMLH1甲基化[14]。本研究结果显示，AML、CML、ALL患者hMLH1基因甲基化异明显升高，hMLH1基因mRNA表达明显下降。结果证明hMLH1基因的异常甲基化在白血病的发生中起着重要作用，可影响hMLH1基因mRNA表达，并作为疾病诊断和预后评估的辅助方法。张启弘等[15]研究表明，甲状腺乳头状癌(PTC)患者的hMLH1基因mRNA呈高表达，hMLH1基因的mRNA表达与疾病的发生发展有关。邹菁等[16]研究表明，AML患者的hMLH1基因mRNA表达受到基因启动子区甲基化的影响，且hMLH1基因甲基化与白血病的发生发展有关，与本研究结果相似。

CDX2基因由3个外显子和2个内含子构成，可以编码核转录因子，在正常组织中具有促进细胞的作用，是控制造血系统早期发育的主要基因[17-18]。本研究结果显示， AML、CML、ALL患者的CDX2基因甲基化均无明显变化；AML、CML、ALL患者的CDX2基因mRNA表达明显升高。结果证明白血病患者CDX2基因的异常甲基化没有下调，可能是其他途径上调了CDX2基因mRNA表达。申淑珍等[19]研究表明，CDX2基因mRNA表达可反映患者的白血病细胞负荷，是评估预后的重要指标。王巍等[20]研究表明， AML、ALL与健康对照组的CDX2基因异常甲基化均为100%，无明显差异，且CDX2基因异常甲基化与CDX2基因的mRNA表达无明显相关性，与本研究结果相吻合。

综上所述，白血病患者ID4、hMLH1、CDX2基因启动子区异常甲基化与白血病的发病机制密切相关，ID4、hMLH1基因的mRNA表达受到甲基化的影响，CDX2基因的mRNA表达与甲基化无关。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

韩松：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；侯志新：提出研究思路，分析试验数据;刘承祥：实施研究过程，资料搜集整理;张雷：进行统计学分析;郑伟 ：课题设计，论文修改，论文审核