甲状腺癌患者血清let-7e、miR-142表达及其与Th17/Treg的相关性分析

周伟清，庄一心，沈卫星，沈育锋，章平

甲状腺癌是内分泌系统的常见恶性肿瘤，女性发病率远高于男性。大多数甲状腺癌患者预后良好，治疗后生存率高，但部分未分化癌预后极差。虽然关于甲状腺癌影响因素研究较多，但由于近年来人们饮食结构、生活环境恶化、遗传、肥胖等因素影响，甲状腺癌发病率逐年上升，严重影响人类生存质量[1]。因此继续探寻甲状腺癌进展中相关因子及指标仍有重要意义。Shan等[2]研究发现，结直肠癌组织中let-7e显著低于癌旁组织，可能与结直肠癌进展有关，下调let-7e可促进癌细胞增殖、侵袭、体外血管生成和肿瘤生长。有研究表明，let-7e在非小细胞肺癌中表达下调，可能与患者生存率有关[3]。miR-142在肝癌组织中低表达，过表达miR-142可明显诱导癌细胞凋亡。胡潺潺等[4]研究报道，乳腺癌组织和细胞中miR-142表达下调，与癌细胞侵袭性有关，上调miR-142表达可抑制癌细胞侵袭和迁移[5]。由于辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)/调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)水平与肿瘤进展有关，且甲状腺癌中let-7e、miR-142表达水平及与Th17/Treg关系未见报道，因此本研究通过检测甲状腺癌患者血清let-7e、miR-142表达水平及患者外周血Th17/Treg水平，分析let-7e、miR-142表达与Th17/Treg水平关系，以期为甲状腺癌患者临床治疗和预后改善提供一定理论依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年5月—2019年6月复旦大学附属中山医院青浦分院普外科收治的甲状腺癌患者(甲状腺癌组)109例，其中男41例，女68例，年龄28～65(47.25±9.87)岁。纳入标准：(1)经临床及病理组织切片检查确诊为甲状腺癌；(2)患者入组前未进行任何治疗；(3)临床资料完整。排除标准：(1)合并患有其他部位肿瘤者；(2)心脏、肾脏、肝脏等功能严重不全者；(3)患有严重精神疾病者。根据美国癌症联合会TNM分期系统[6]将入组患者分为：Ⅰ～Ⅱ期56例，Ⅲ期53例；根据病理分型分为：乳头状癌83例，滤泡型癌10例，未分化癌9例，髓样癌7例；根据是否有淋巴结转移分为：无淋巴结转移39例，有淋巴结转移70例。另选取同期在医院健康体检者109例作为健康对照组，其中男43例，女66例；年龄29～63(48.03±8.96)岁。2组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，受试者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器 (1)主要试剂：总RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)；反转录试剂盒(美国Thermo公司)；实时荧光定量(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)试剂盒(日本Takara公司)。主要仪器：qRT-PCR仪(ABI 7500，美国ABI公司)；流式细胞仪(CytoFLEX，美国贝克曼库尔特有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 样本采集： 甲状腺癌组患者和健康对照组分别于入组后和体检时(07∶00～09∶00)空腹采集外周静脉血5 ml，3 ml在4℃、3 000 r/min条件下离心15 min，用于qRT-PCR和ELISA试验，2 ml用于流式细胞术检测。

1.3.2 血清let-7e、miR-142表达水平检测： 使用Trizol法提取总RNA，反转录后得到cDNA，进行qRT-PCR试验。20 μl反应体系如下，10 μl SYBR2Taq Ⅱ，2 μl cDNA，0.4 μl ROX，0.8 μl上游引物，0.8 μl下游引物，ddH2O 6.0 μl。qRT-PCR反应步骤如下，95℃、35 s，1循环；95℃、5 s；63℃、34 s，38循环。每个样本重复3次，用2-△△CT法计算let-7e、miR-142表达水平，所用引物见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 流式细胞术检测Th17及Treg细胞水平: 取入组者外周血5 ml，加入PBS缓冲液混匀后滴入装有10 ml ficoll分离液离心管中，离心后取中层单个核细胞，显微镜下计数。将所得单个核细胞稀释到相应浓度后于细胞培养箱培养4 h。收集培养后细胞，分成2份，分别加入相应单抗，用流式细胞仪进行检测，严格按照说明书进行操作。以CD4+IL-17+在CD4+T细胞中百分比表示Th17水平，CD4+CD25+Foxp3+细胞在CD4+T细胞中百分比表示Treg细胞水平。

1.3.4 血清相关细胞因子水平检测: 采用ELISA法检测白介素10(IL-10)、白介素17(IL-17)、白介素23(IL-23)、白介素6(IL-6)及转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)水平，严格按照试剂盒说明书进行操作，试剂盒购自上海群己生物科技有限公司。

2 结 果

2.1 2组血清中let-7e、miR-142表达水平比较 甲状腺癌组患者血清中let-7e、miR-142表达水平均显著低于健康对照组(P均<0.01)，见表2。

表2 2组受试者let-7e、miR-142表达水平比较

2.2 2组外周血Th17、Treg细胞比例比较 甲状腺癌组患者外周血Th17细胞比例、Treg细胞比例及Th17/Treg均显著高于健康对照组(P均<0.01)，见表3。

表3 2组受试者Th17、Treg细胞比例比较

2.3 血清let-7e、miR-142及外周血Th17/Treg与甲状腺癌患者临床病理特征的关系 let-7e、miR-142及Th17/Treg水平与甲状腺癌患者性别、年龄、肿瘤直径和病理分型无关(P均>0.05)，与TNM分期和淋巴结转移有关(P均<0.01)，见表4。

2.4 2组血清Th17、Treg细胞相关细胞因子水平比较 甲状腺癌患者血清IL-10、IL-17、IL-23、IL-6及TGF-β水平显著高于健康对照组(P均<0.01)，见表5。

2.5 甲状腺癌患者let-7e、miR-142表达与Th17/Treg水平相关性分析 甲状腺癌患者血清let-7e表达水平与外周血Th17/Treg水平呈负相关(r=-0.337，P=0.000)，血清miR-142表达水平与外周血Th17/Treg水平呈负相关(r=-0.402，P=0.000)，见图1、图2。

2.6 甲状腺癌患者血清let-7e、miR-142表达与细胞因子相关性分析 甲状腺癌患者血清let-7e、miR-142表达水平与IL-6无关(P>0.05)，与IL-10、IL-17、IL-23及TGF-β水平均呈负相关(P均<0.01)，见表6。

表4 let-7e、miR-142及Th17/Treg水平与甲状腺癌患者临床病理特征的关系

表5 2组血清Th17、Treg细胞相关细胞因子水平比较

图1 甲状腺癌患者let-7e与Th17/Treg水平相关性

图2 甲状腺癌患者miR-142与Th17/Treg水平相关性

表6 甲状腺癌患者血清let-7e、miR-142表达与细胞因子相关性分析

细胞因子let-7er值P值miR-142r值P值IL-10-0.4350.000-0.5070.000IL-17-0.3270.001-0.4040.000IL-23-0.3920.000-0.4530.000IL-6-0.2010.087-0.2130.076TG-β-0.3760.000-0.4270.000

3 讨 论

甲状腺癌早期表现为颈部甲状腺出现非对称性肿块、咽喉有压抑感、颈部疼痛等，但由于早期症状无典型性特征，甲状腺癌易进展至中晚期。中晚期甲状腺癌患者出现呼吸不畅、吞咽困难、颈部放射痛、淋巴结肿大、转移至其他部位引起其他器官病变，严重威胁患者生存[7]。甲状腺癌发生发展中相关影响因子仍是甲状腺癌研究重要部分。微小RNA(micro RNA，miRNA)是一类短链非编码RNA，能参与多种疾病调控。研究表明，miR-126-3p在甲状腺癌组织中表达水平显著低于癌旁组织，上调其表达可抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进凋亡[8]。Bai等[9]研究发现，miR-150在甲状腺癌组织中明显下调，体外过表达可诱导癌细胞周期阻滞，提示多种miRNA可参与调控甲状腺癌进展。

有研究报道，miRNA家族成员let-7e在上皮性卵巢癌中低表达，与患者无进展生存率较差有关[10]。本研究结果中，甲状腺癌患者血清let-7e表达水平显著低于健康对照组，与Xiao等[10]研究结果相似，提示患者血清中let-7e表达水平可能与甲状腺癌发生有关。Gong等[11]研究发现，let-7e在胶质母细胞瘤组织中表达低于正常脑组织，let-7e可通过抑制细胞增殖、侵袭、迁移和促进细胞凋亡，抑制肿瘤进展。本研究结果显示，甲状腺癌患者血清let-7e表达水平与TNM分期和淋巴结转移有关，提示let-7水平可能与甲状腺癌发展有关。

Lu等[12]研究发现，胰腺癌组织和细胞系中miR-142表达显著下调，参与胰腺癌细胞增殖和侵袭调控。研究表明，miR-142在食管鳞癌组织中明显低于癌旁组织，与淋巴结转移、临床分期及患者预后有关[13]。另有研究报道，miR-142在胃癌组织中低表达，可抑制癌细胞迁移和侵袭，与患者复发等不良预后有关[14]。本研究结果显示，与健康对照组相比，甲状腺癌患者血清miR-142表达水平显著降低，与Yan等[14]在胃癌中研究结果一致。进一步分析发现，miR-142表达与甲状腺癌患者TNM分期和淋巴结转移有关，提示miR-142可能参与甲状腺癌进展。

Th17细胞能分泌IL-17，通过促进炎性反应参与机体免疫系统调控。有研究发现，非小细胞肺癌患者外周血Th17细胞比例显著高于健康对照组，与非小细胞肺癌临床分期有关[15]。本研究结果显示，甲状腺癌患者外周血Th17细胞比例显著高于健康对照组，提示外周血Th17细胞比例升高可能与甲状腺癌发展有关。Treg细胞能维持机体免疫耐受，通过抑制免疫反应维持免疫系统平衡。研究表明，非小细胞肺癌组织中Treg浸润明显高于癌旁组织，与TNM分期和淋巴结转移有关[16]。本研究结果中，甲状腺癌患者外周血Treg细胞比例显著升高，提示外周血Treg细胞比例异常可能影响甲状腺癌发生发展。另外，研究报道，与健康对照组相比，非小细胞肺癌患者Th17/Treg比值明显升高，可能影响癌细胞分化[17]。李清靖等[18]发现，胃癌患者外周血Th17/Treg明显升高，与TNM分期、分化程度、淋巴结转移有关。本研究结果显示，甲状腺癌患者外周血Th17/Treg比值明显高于健康对照组，且与TNM分期、发生淋巴结转移有关，提示甲状腺癌患者体内Th17/Treg平衡被打破，可能影响甲状腺癌发生发展。

Navarro等[19]研究表明，Th17细胞因子IL-17可调控乳腺癌细胞增殖和迁移，可能与肿瘤进展及患者预后有关。Th17可通过调控IL-23及IL-6促进结肠癌及大肠癌进展[20-21]。刘勇等[22]发现，Treg细胞与TGF-β、IL-10水平呈正相关，共同参与肝癌患者体内免疫调控过程。本研究结果显示，甲状腺癌患者血清中与Th17/Treg相关因子IL-10、IL-17、IL-23、IL-6及TGF-β水平显著升高，提示Th17/Treg比例失衡可能导致相关因子水平异常，影响甲状腺癌发生发展。进一步研究发现，甲状腺癌患者血清let-7e、miR-142表达水平与外周血Th17/Treg水平及其相关因子IL-10、IL-17、IL-23、TGF-β水平呈负相关，提示let-7e、miR-142可能通过调控Th17/Treg比值影响相关细胞因子水平，在甲状腺癌进展中发挥作用。

综上所述，与健康对照组相比，甲状腺癌患者血清let-7e与miR-142表达水平下调，Th17/Treg水平上调，与患者TNM分期及淋巴结转移有关，且血清let-7e、miR-142表达水平与Th17/Treg及其相关因子水平均呈负相关，提示let-7e、miR-142与Th17/Treg之间可能存在调控机制，共同参与甲状腺癌发生发展。但由于本研究样本量较少、研究方法较为单一，具体作用机制尚需进一步深入研究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

周伟清：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；庄一心：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；沈卫星：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；沈育锋：进行统计学分析；章平：课题设计，论文撰写