高效液相色谱法同时测定莨菪浸膏片中的4种活性组分

杜晖，任静，郑妍

莨菪浸膏片由三分三浸膏或颠茄浸膏制成，为抗胆碱药，具有解除平滑肌痉挛和抑制腺体分泌等功能，其主要成分为莨菪类生物碱。现行标准中只有鉴别和检查，无含量测定部分。现有文献关于托烷类生物碱常用测定法为酸性染料比色法［1］、高效液相色谱法［2-5］、毛细管电泳法［6］、色谱-质谱联用法［7-11］等。但目前检测方法仅针对相关药物中硫酸阿托品等3种极性较强的莨菪碱［12-15］含量的测定，有质控指标的缺陷，存在化学原料药投料的风险［16-17］。东莨菪内酯是一种香豆素类化合物，具有显著的抗癌、抗氧化、抗炎和杀螨［18-19］等作用。除常规的3种生物碱外，本研究2017年10月至2018年6月增加了东莨菪内酯的分离测定，为莨菪浸膏片的辨伪存真和质量标准的建立提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药 戴安U3000高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器（美国赛默飞世尔公司）；HC-3018R型低温冷冻高速离心机（合肥科大创新股份有限公司）；Milli-QAdvantage超纯水机（美国密理博公司）。

莨菪浸膏片为市售药品（西安利君制药有限责任公司，生产批号1509559，规格24μg总碱量；沈阳同联集团，生产批号151004～151006，规格30μg总碱量）；氢溴酸东莨菪碱（生产批号100049～201009）、氢溴酸山莨菪碱（生产批号100051～201607）、硫酸阿托品（生产批号100040～201613）和东莨菪内酯（生产批号110768～200504）。对照品购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯（美国霍尼韦尔公司）；其他试剂为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制备

1.2.1.1 样品溶液 取莨菪浸膏片30片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于总碱量0.3 mg），置离心管中，精密加入甲醇5 mL，密塞，置水浴中超声提取15 min，再精密加入0.05 mol/L硫酸溶液5 mL，0.45μm滤膜过滤即得。

1.2.1.2 对照品溶液 精密称取氢溴酸东莨菪碱10.07 mg、氢溴酸山莨菪碱9.95 mg、硫酸阿托品9.68 mg和东莨菪内酯10.03 mg，分别置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，分别精密量取0.5、1、2、5、10和20 mL，置100 mL量瓶中，用甲醇-0.05 mol/L硫酸溶液（1∶1）稀释至刻度，即得。

1.2.2色谱条件色谱柱为Welch C18（150 mm×4.6 mm，5μm）；以甲醇为流动相A，0.05%磷酸溶液为流动相B，二元梯度洗脱（0～35 min，A相由3%上升至 25%；35.0～40.0 min，A 相上升至 50%；40.0～45.0 min，A相维持在50%；45.1～50.0 min，A相维持在3%）；流速为1.0 mL/min，柱温30℃，进样量20 μL，检测波长215 nm。

2 结果

2.1 专属性考察 分别吸取供试品和对照品溶液，按1.2.2项色谱条件进行液相分析，记录色谱图如图1所示，样品中杂质峰非常多，但被分析物与干扰组分得到了有效的分离，分离度均大于1.5。

2.2 线性范围和检测限的考察 精密量取1.2.1.2项所配置的东莨菪碱、山莨菪碱、阿托品和东莨菪内酯的混合对照品溶液，按1.2.2项色谱条件进行液相分析，以峰面积y（mAU/min）对样品浓度x（μg/mL）进行线性回归，相关系数均在0.999 3以上，如表1所示。当S/N约为3时，计算出4种组分的检测限分别为1.2、1.5、0.5和1.6 ng。

2.3 重复性及稳定性考察 将批号为1509559样品溶液连续进样6次，发现4种组分保留时间和峰面积的RSD值分别为0.15%、0.13%、0.07%、0.10%和0.70%、0.69%、0.98%、0.38%，证明该方法的重复性满足实验要求。

将批号为1509559样品溶液保存在4℃环境中，并在24、48、72 h和1周后进样分析，发现4种组分峰面积的RSD值分别为1.50%、1.79%、1.85%和2.02%，样品在1周内保持稳定。

图1 莨菪浸膏片供试品（A为沈阳同联151006、B为西安利君1509559）和对照品（C）的高效液相色谱图

表1 莨菪浸膏片中4种组分的回归方程、相关系数、线性范围和检测限

2.4 样品测定及回收率考察 按1.2.1.1方法对样品进行前处理，按1.2.2项色谱条件进行液相分析，测得4批莨菪浸膏片中4种组分的含量，如表2所示。3种生物碱含量的和相比药品规格略低，考虑可能是样品中还存在少量其他种类的生物碱。

表2莨菪浸膏片4批样品中4种组分的含量/（微克/片，±s）

样品西安利君1509559沈阳同联151004沈阳同联151005沈阳同联151006东莨菪碱3.23±0.13 1.60±0.06 1.52±0.05 1.52±0.05山莨菪碱0.75±0.03 1.01±0.03 1.02±0.03 1.00±0.04阿托品15.30±0.45 25.55±0.60 25.30±0.57 25.81±0.53东莨菪内酯1.25±0.04 4.01±0.14 4.05±0.20 4.50±0.18

按1.2.1.1方法测定批号为1509559的莨菪浸膏片中的4种组分，并向样品中准确加入高中低3种浓度的标准溶液，每组浓度平行3份，计算回收率，测定结果如表3所示，平均回收率在98.3%～100.0%之间，RSD小于2.8%。

3 讨论

3.1 检测波长 东莨菪碱等3种生物碱均是末端吸收，而东莨菪内酯的最大吸收波长是220和350 nm。当检测波长小于210 nm时，基线不平稳，干扰较明显；当波长大于220 nm，4种成分的紫外吸收又明显减弱。综合考虑，检测波长设为215 nm。

表3 莨菪浸膏片4种组分的回收率

3.2 提取溶剂 比较了相同的超声时间和条件下，甲醇、水和0.05 mol/L硫酸溶液等3种溶剂的提取率和样品出峰情况。参考文献［14］并试验发现，利用0.05 mol/L硫酸溶液提取阿托品等生物碱，样品干扰少且重复性较好，但是东莨菪内酯提取率较低；甲醇作为溶剂可以兼顾所有目标成分的提取，但溶剂与流动相极性差别较大导致色谱峰拖尾严重；故我们在用甲醇提取样品后加入同体积的0.05 mol/L硫酸溶液，从而满足我们分析要求。

3.3 流动相 实验中我们考虑了甲醇-水、甲醇-0.05%磷酸溶液（15∶85和20∶80）等度洗脱，虽然东莨菪碱和山莨菪碱的出峰时间较快，但是与相邻杂质峰无法完全分离；而东莨菪内酯则在40 min左右出峰，整体分析时间较长。考虑到包括东莨菪碱在内的几种生物碱极性相近，我们将起始甲醇比例降为3%，采用梯度洗脱，到35 min时，甲醇的比例提高到25%，4种成分在30 min出峰完毕，峰形对称无干扰；而后调整有机相比例，使弱极性组分快速洗脱完毕。

4 结论

相比文献［12，14］，本研究增加了样品中东莨菪内酯的分离测定，并且将分析时间大幅度缩短至50 min。本研究采用甲醇提取莨菪浸膏片中的有效成分，促使弱极性的东莨菪内酯有效溶出；而后再同比例加入酸水，减小了溶剂与流动相极性的差别从而兼顾了峰形。莨菪浸膏片原有标准中无含量测定项目，鉴别项目涉及的是托烷类生物碱，没有针对性。本研究所述方法对莨菪浸膏片中4种组分进行了分离测定，控制了该药品非法添加化学原料的问题，可用于莨菪浸膏片的质量控制。