基于网络药理学对沙利度胺治疗原发性肝癌作用机制的研究

唐伟智，侯恩存，唐友明，郑景辉，吴竞，谢俊宇

在我国恶性肿瘤发病率中，原发性肝癌位列第三，仅次于肺癌和胃癌，其死亡率仅次于肺癌并逐渐上升［1-2］。原发性肝癌的非手术治疗方式主要包括放化疗、介入及生物靶向治疗［3］。经过近年来的临床使用发现，沙利度胺可通过抑制血管生成、调节免疫、诱导凋亡等方面的作用治疗实体肿瘤［4］。沙利度胺在临床使用单药维持，联合放、化疗，及联合肝动脉化疗栓塞术（TACE）治疗肝癌的研究中均有报道沙利度胺的有效性。一项回顾性分析结果显示［5］，53例使用沙利度胺治疗的晚期肝癌病人，6例缓解，疾病控制15例，中位生存期10.5月，1年生存率为45%，2年为20%，且没有发生严重不良反应的病人。两篇荟萃分析结果显示TACE联合沙利度胺治疗肝癌的临床疗效优于单纯TACE［6-7］。但沙利度胺治疗肝癌的有效性仍存在争议，一项病案报道发现，沙利度胺联合赛庚啶治疗肝细胞肝癌的病人在停用沙利度胺后的近一年时间内仍能维持肝肿瘤和肺转移完全缓解［8］。Woo K等［9］一项实验表明，沙利度胺不能用于抗肝癌治疗，但它的衍生物因能诱导生长停滞、选择性地诱导致瘤性肝祖细胞的凋亡而具有抗肿瘤药物的潜力。故沙利度胺治疗肝癌的疗效及作用机制仍需进一步探索。

本研究起止时间为2018年6—12月，通过网络药理学及分子对接的角度研究沙利度胺治疗原发性肝癌的可能作用机制。网络药理学基于“药物-靶点-基因-疾病”原理的相互作用网络，进行药物对疾病网络的干预和影响系统综合的观察［10］。分子对接则是通过计算机模拟配体置于受体的结合区域，即“锁-钥原理”，计算预测两者间的结合亲和性，进而阐明药物作用机制［11］。

1 材料与方法

1.1 靶点的筛选 通过PubChem数据库查询沙利度胺的分子结构，保存为Smiles格式。Swiss Target Prediction数据库可以根据二维和三维相似性度量与已知配体的组合，精确预测生物活性分子的目标［12］。将沙利度胺的分子Smiles结构导入该数据库相关的靶点信息。通过CTD、GeneCards及Liverome数据库收集与原发性肝癌（Liver Neoplasms）相关的靶点，筛选出三个数据库共有的基因，与沙利度胺相关靶点相映射，获得沙利度胺治疗原发性肝癌的潜在作用靶点。并利用DisGeNET数据库［13］分析靶点类型。

1.2 蛋白质相互作用网络的构建 将沙利度胺的潜在作用靶点通过String数据库［14］进行蛋白质-蛋白质相互作用分析，分析结果网络关系图使用Cytoscape 3.6.1软件进行可视化，每一个节点（Node）对应一个蛋白靶点。使用软件中插件Network Analyzer进行网络特征分析，节点的度值（Degree）大小代表该蛋白在网络中的重要性，根据Degree大小设置节点的颜色。

1.3 基因本体论（Gene Ontology，GO）分析DAVID在线生物数据分析工具可以提供来自基因组研究的大量基因的功能解释，提供典型的基因术语富集分析［15］。将沙利度胺治疗原发性肝癌的潜在作用靶点导入DAVID，研究物种限定为人类，GO分析内容选择生物进程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF），这三个部分分析数据使用绘图软件Graphpad 7绘制成条形图。

1.4 通路分析 京都基因和基因组百科全书（KEGG）是一个基因组序列和其他高通量数据的生物学解释的综合数据库［16］，KEGGMapper是数据库中用于KEGG映射的工具。将沙利度胺潜在作用靶点导入KEGGMapper中，通路分析结果通过Omicshare数据库绘制成气泡图，“靶点-通路”网络图通过Cytoscape软件构建。

1.5 分子对接 通过沙利度胺的结构分子与潜在作用靶点进行分子对接，验证预测结果的可靠性。沙利度胺潜在作用靶点的PDB iD通过PDB（http：//www.rcsb.org/pdb/）查找。沙利度胺的分子结构通过Pubchem数据库下载保存为Mol2格式，导入到系统对接网站（Systems Dock Web Site）进行在线分子与靶蛋白对接，预测其结合活性［17］。基于DocK-IN评分，数值从0到10表示结合活性从弱到强，Score值＞7代表结合活性强烈，Score值＞5代表结合活性较好［15］。

2 结果

2.1 沙利度胺潜在作用靶点 将沙利度胺的Smiles格式导入Swiss Target Prediction，得到预测靶点15个。通过对CTD、GeneCards及Liverome数据库进行检索及整理，三个数据库的共同肝癌靶点有5546个，与沙利度胺的预测靶点进行匹配，最后得到11个沙利度胺治疗原发性肝癌的潜在靶点（PTGS2、DPP4、DPP9、P2RX7、PARP1、MBNL1、MBNL2、MBNL3、MMP2、MMP9、MMP1）。将11个靶点导入DisGeNET数据库，结果表明沙利度胺作用于原发性肝癌过程中主要涉及各种酶（氧化还原酶、水解酶、转移酶、连接酶）。

2.2 蛋白质相互作用网络分析 将沙利度胺11个潜在作用靶点通过String数据库进行蛋白互作分析，通过Cytoscape软件进行网络图可视化，见图1。网络中共有节点9个，边10个，其中MBNL2、P2RX7不在该蛋白互作关系中。节点的颜色越深，代表该节点Degree值越大。网络中degree值较大的靶蛋白为PTGS2、MMP9（degree值＝4），表示这些蛋白在蛋白互作网络中较为重要，见表1。

图1 沙利度胺的蛋白质相互作用网络

2.3 潜在作用靶点GO分析 图2为沙利度胺治疗原发性肝癌潜在靶点的GO分析结果，生物进程主要为蛋白质水解（5个靶点）。细胞组成主要为细胞核（7个靶点）、细胞外基质（3个靶点）。分子功能主要为丝氨酸型肽链内切酶活性、相同蛋白结合、多聚腺嘌呤核糖核苷酸结合及锌离子结合（均为4个靶点）等。

表1 沙利度胺治疗原发性肝癌潜在作用靶点信息

图2 沙利度胺治疗原发性肝癌潜在靶点的GO富集分析：A为生物进程；B为细胞组成；C为分子功能（个）

2.4 潜在作用靶点代谢通路分析 基于KEGG通路分析，结果显示11个沙利度胺治疗原发性肝癌潜在作用靶点参与了41条通路，将富集程度（Rich Factor）前20的通路（P＜0.05）绘制成气泡图，其主要富集于癌症通路（Pathways in cancer）、核因子κB信号通路（NF-kappa Bsignaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）及血管内皮生长因子信号通路（VEGF signaling pathway）等通路。4条信号通路涉及4个靶点，分别为MMP1、MMP9、MMP2及PTGS2。表明沙利度胺治疗原发性肝癌的潜在靶点分布于不同通路协调发挥作用。其“靶点-通路”网络图中，PTGS2、MMP-9的度值较大（Degree值分别为20、14），表明沙利度胺主要通过PTGS2、MMP-9作用于各种通路。

2.5 分子对接分析 将沙利度胺与11个靶蛋白进行分子对接，结果显示，沙利度胺分子与除MBNL2外的10个靶蛋白有良好的相互作用，见表2。结果表明了预测靶点的可靠性。

表2 沙利度胺与靶点的分子对接得分

3 讨论

本研究通过预测沙利度胺的相关靶点，整合CTD、GeneCards及Liverome数据库中的原发性肝癌相关靶点，最后获取沙利度胺治疗原发性肝癌的11个潜在作用靶点，主要由氧化还原酶、水解酶、转移酶、连接酶等各种酶参与。其中，COX-2（PTGS2）在肝细胞中的高表达可通过减少TET1，沉默肿瘤抑制基因和激活关键的致癌途径诱导启动子甲基化来诱导肝细胞肝癌的发生［18］。而沙利度胺具有良好的环氧化酶抑制活性［19］。有研究报道［20］，沙利度胺可抑制 metalloproteinase-9（MMP-9）的活性，抑制MMP-9有助于褪黑素预防HepG2肝癌细胞的运动和侵袭性［21］。沙利度胺亦可抑制MMP-1和MMP-2的活性［20-22］。

通过GO分析，结果显示沙利度胺的潜在作用靶点主要涉及生物进程的蛋白质水解及分子功能的丝氨酸型肽链内切酶活性、相同蛋白结合、多聚腺嘌呤核糖核苷酸结合和锌离子结合。这些生物过程与维持细胞正常的生理功能相关［23-24］，表明沙利度胺可参与调节多种生物过程治疗原发性肝癌。

基于KEGG通路分析，沙利度胺潜在靶点的代谢通路主要富集于癌症通路、核因子κB信号通路、肿瘤坏死因子信号通路及血管内皮生长因子信号通路等通路。NF-κB是一种可以参与炎症、细胞增殖和凋亡的转录因子［25］，研究表明［26］，NK-κB在肝癌肝内血管侵犯转移相关。TNF-α是一种多效性炎性细胞因子，炎症诱导的细胞毒性CD8+T淋巴细胞活化抑制作为肿瘤发展的重要机制，超过90%的肝细胞肝癌在肝损伤和炎症的情况下出现［27-28］。TNF-α的阳性表达亦对肝癌的发生发展起促进作用［26］。推测沙利度胺通过抑制NF-κB通路及其对TNF-α表达的诱导发挥治疗肝癌的作用，该作用与文献报道相符［29］。

癌症的主要标志之一是诱导血管生成，新生血管的生长可向恶性细胞提供充足的氧气和营养，而血管内皮生长因子（VEGF）是胚胎、成人生理和病理过程中血管生成的主要驱动因子［30］。在肿瘤的持续生长过程中，肿瘤内部发生缺氧使VEGF的表达增加，促进肿瘤边缘部位形成新的血管［31］。研究表明［32-33］，沙利度胺可显著减少人血清中VEGF的水平。推测沙利度胺在VEGF信号通路中通过抑制VEGF表达发挥抗血管生成从而治疗原发性肝癌的作用。沙利度胺抗血管生成作用与文献报道相符［34］。

沙利度胺通过调控多通路协调发挥治疗原发性肝癌的效果，文献报道与本研究相关通路分析相符，因此预测的结果具有一定的可靠性。沙利度胺治疗原发性肝癌的通过作用于11个潜在作用靶点，参与调控多条通路，表明了沙利度胺可通过多靶点、多通路途径治疗原发性肝癌的特点。