苯环喹溴铵对组胺诱导的人鼻黏膜上皮细胞表达MUC5AC 的影响

杨敏，黄江菊，龙锐，李娟，骆文龙

（1.重庆医科大学附属第二医院耳鼻咽喉头颈外科，重庆；2.重庆医科大学附属第一医院，重庆）

0 引言

鼻黏膜分泌亢进是鼻腔炎症性疾病如急慢性鼻炎、鼻窦炎、过敏性鼻炎的主要特点之一。黏蛋白是一类高度糖基化的大分子蛋白，主要分为分泌型和膜结合型。MUC5AC 是人类气道上皮细胞中重要的分泌型黏蛋白，是气道黏液的主要成分之一。本课题组前期研究表明，MUC5AC 在体外培养的人鼻黏膜上皮细胞炎症模型中表达明显升高[1]。苯环喹溴铵是一种M3 受体阻断剂，这种选择性抗胆碱药能够很好的抑制气道炎症[2,3]。本课题组成员前期已做了研究，证实BCQB 对大鼠变应性鼻炎模型MUC5AC 具有很好的抑制作用[4]，本实验目的在于从人类细胞水平探讨BCQB对黏蛋白MUC5AC 表达的影响，从而为鼻腔炎症性疾病提供新的药物治疗方案。

1 材料与方法

1.1 标本来源

本实验所提取的标本来源于重庆医科大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科鼻科组收治入院的鼻中隔偏曲和阻塞性睡眠呼吸暂停综合征患者，于鼻腔扩容术或鼻中隔成型术中取得的无炎症钩突组织用于实验。患者无慢性鼻-鼻窦炎、真菌性鼻窦炎、过敏性鼻炎以及其他变态反应性疾病史，取材近1 月内未使用糖皮质激素及其他抑制细胞生长的药物，无手术外伤史。

1.2 药品与主要试剂

胎 牛 血 清、DMEM/F12（1：1）培 养 基 购 于 美 国Gibco 公司，表皮生长因子、内皮细胞生长因子、全反式维甲酸、转铁蛋白、鼠抗人单克隆抗体细胞角蛋白CK18、I 型胶原酶、核酸染料hoechst33258、组胺、苯环喹溴铵均购于美国Sigma 公司，青链霉素双抗购于中国上海碧云天生物技术公司， ELISA 试剂盒购于中国上海西塘生物公司，ECL 发光试剂盒购于美国Millipore 公司，RNA 提取试剂盒Trizol、逆转录试剂盒、PCR 引物均购于日本Takara 公司，胰岛素及两性霉素B 由重庆医科大学附属第一医院提供。

1.3 鼻黏膜上皮细胞原代培养及鉴定

将术中取下的人钩突组织经分离，纯化后先用血清培养基培养24 小时，待细胞贴壁后换成含生长因子的无血清培养基继续培养至细胞接近汇合时进行传代。取第2 代细胞进行后续实验。原代细胞培养近汇合时行免疫荧光检测上皮细胞特异性抗原细胞角蛋白CK18 的表达。具体见本课题组前期研究[1]。

1.4 实验分组及处理

将鼻黏膜上皮细胞分成对照组（C）、组胺组（H）、苯环喹溴铵组（BCQB）、异丙托溴铵组（IB）。对照组加入无血清培养基；组胺组加入含组胺（10-4 mol·L-1）的无血清培养基，浓度选择来源于王振霖的研究[5]；苯环喹溴铵组（BCQB）先加入含BCQB（10-6 mol·L-1）无血清培养基孵育30 分钟后，再加入组胺（10-4 mol·L-1）；异丙托溴铵组（IB）先加入IB（10-6 mol·L-1）无血清培养基孵育30 分钟后，再加入组胺（10-4 mol·L-1）。干预后各组放5% CO2 培养24 小时。

1.5 Real-time PCR 检测 MUC5AC mRNA 表达

提取细胞总RNA 后逆转录为cDNA，采用CFX96 荧光 定 量PCR 仪 检 测MUC5AC mRNA 的 表 达。MUC5AC 上游 引 物5’-TACCAGTGCCAGTGTGTGTGC-3’，下 游 引 物5’-GCCATACACGGGCACAATCT-3’，扩增片段大小为126bp；GAPDH 上游引物5’-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3’，下游引物5’-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3’，扩增片段大小为132bp。反应体系为：模板1μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，SYBR 荧光酶5μl，DEPC 水3.2μl，共10μl。反应条件为95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，共40 个循环。反应结束，软件自动分析出MUC5AC mRNA 的相对表达量。

1.6 ELISA 法检测 MUC5AC 蛋白表达

收集各组上清液，2000 r·min-1，离心15 分钟，采用双抗夹心法定量检测上清液中黏蛋白MUC5AC 的表达量，严格按照说明书步骤进行操作。酶标仪检测450 nm 处吸光值（A）。根据标准曲线将A 值换算成浓度值。

1.7 统计学分析

2 实验结果

人鼻黏膜上皮细胞原代培养结果及免疫荧光鉴定可参照本课题组前期研究，在此不再赘述[1]。

2.1 Real-time PCR 检测MUC5AC mRNA 表达

图1 人鼻黏膜上皮细胞中MUC5AC mRNA 在各组中的表达

2.2 ELISA 检测MUC5AC 蛋白表达

图2 ELISA 检测上清液中MUC5AC 蛋白表达 (ng/mL)

3 讨论

在人类气道上皮中，黏液是一种由水和黏蛋白组成的复合分泌物[6]。这种黏液对于保护气道免受外界环境侵害中起到重要作用。黏蛋白作为一种高度糖基化大分子蛋白，赋予黏液的物理学和生物学特性[7]。MUC5AC 是人类气道上皮细胞中重要的分泌型黏蛋白，是气道黏液的主要成分之一。已有研究表面MUC5AC 在体外培养的人鼻粘膜上皮细胞中表达升高[2]。组胺作为一种炎症介质，在鼻腔炎症性疾病，尤其是过敏性鼻炎中表达明显升高。王振霖等人的研究表明，组胺能够刺激体外培养的人鼻粘膜上皮细胞高表达MUC5AC。本课题组成员的前期动物实验也以组胺作为诱导剂，成功制造大鼠变应性鼻炎模型，在大鼠鼻黏膜中检测到MUC5AC 高表达[4]。因此，本实验选择组胺作为炎症诱导剂，实验结果证明，组胺能够在细胞水平成功诱导人鼻粘膜上皮细胞高表达MUC5AC，由此证明组胺能够用于后续实验。

刘维会课题组研究发现[8]， 溴化异丙托品，一种M 胆碱能受体拮抗剂，能够显著减少慢性支气管炎大鼠模型支气管肺泡灌洗液( BALF)、气管培养液、上皮以及黏膜下的腺体细胞中黏蛋白的含量。Bos 等[9]的研究表明， M 受体拮抗药噻托溴铵既能抑制过敏原诱导的黏液腺体增生，还能降低黏蛋白MUC5AC 基因表达水平。我们的前期研究表明M 受体拮抗剂能够降低鼻黏膜上皮细胞MUC5AC 的表达[1]。由此表明，M 受体拮抗剂能够降低气道黏蛋白的表达，从而缓解气道炎症的高分泌现象。根据“同一气道同一疾病，(one airway one disease)的”观点[10]，上、下呼吸道在组织结构上是延续的，具有高度相似性，且上、下气道的各类疾病是也是密切相关的。M 受体拮抗剂可能通过下调上气道MUC5AC 的表达对鼻腔炎症性疾病的分泌亢进起到抑制作用。

苯环喹溴铵是一种选择性M3 受体拮抗剂，是我国自主研发的药物，已获得中国专利，有望成为气道高分泌性疾病的治疗新药。本课题组的前期研究表明，苯环喹溴铵能够改善大鼠变应性鼻炎症状，抑制大鼠气道MUC5AC 的表达[4]。我们的研究还提示苯环喹溴铵能够抑制脂多糖诱导的体外培养的人鼻黏膜上皮细胞MUC5AC 的表达[1]。在本研究中，我们在体外细胞水平研究了苯环喹溴铵对组胺诱导的人鼻黏膜上皮细胞表达黏蛋白MUC5AC的影响。实时荧光定量PCR 结果中，组胺组黏蛋白基因MUC5AC mRNA 的表达与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01），苯环喹溴铵组与组胺组相比，MUC5AC mRNA 的表达差异有统计学意义（P＜0.01），提示苯环喹溴铵能够从核酸水平抑制组胺诱导的人鼻黏膜上皮细胞表达MUC5AC。从ELISA 检测结果看出，组胺组上清液中MUC5AC 蛋白表达与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.01），且苯环喹溴铵组与组胺组相比，MUC5AC 蛋白的表达差异有统计学意义（P＜0.01），提示BCQB 能够从蛋白水平抑制组胺诱导的人鼻黏膜上皮细胞表达MUC5AC。结合PCR 和ELISA实验结果，我们的研究表达，BCQB 能够抑制组胺诱导的人鼻黏膜上皮细胞黏蛋白MUC5AC 的表达。

综上述，本研究提示，苯环喹溴铵能够抑制组胺诱导的体外培养的人鼻黏膜上皮细胞黏蛋白MUC5AC 的表达，进一步提示其有望成为鼻腔高分泌性疾病治疗新药。