2型猪链球菌河南株cps2J基因的遗传进化关系分析

张青娴，徐引弟，王治方，朱文豪，许 峰，王克领

（1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002；2.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南 郑州 450002）

猪链球菌是世界范围内养猪业重要的细菌性疾病之一，2型猪链球菌（Streptococcus suis serotype2,S.suis2）是一种人畜共患病原体，可引发仔猪和人类的败血症、脑膜炎[1-3]。目前认为猪链球菌毒力因子主要有荚膜多糖（Capsular polysaccharide,cps）、溶血素（suilysin,sly）、溶菌酶释放蛋白（muramidase-released protein,mrp）、胞外因子（extracelluar protein factor,ef）、谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase,gdh）、纤连结合蛋白（ibronectin-binding proteins,fbns）以及黏附素（adhesin）等[1-3]。其中，gdh位于猪链球菌菌体细胞壁上，是一种新近发现的极其保守的种特异性抗原成分[3]，对细菌的致病性具有重要意义，不同血清型之间编码gdh的氨基酸序列同源性高达99%～100%。猪链球菌的临床菌株通常具有荚膜多糖（capsular polysaccharide,cps），cps是2型猪链球菌感染宿主的重要毒力因子，是传统上用于血清分型的基础。根据荚膜抗原的差异，猪链球菌被分为35种血清型（1型至34型和1/2型）[4-7]。大多数国家患病猪中分离出的菌株主要属于2型血清型，其次是 3、4、5、7、8 和 1/2 型[8-10]。某些欧洲国家分离到较多的血清型9猪链球菌[10-11]。其中血清型2菌株的致病力最强，在人类中具有高度毒性。

2019年5月河南某猪场发生一起疑似猪链球菌疫情，断奶仔猪发生呼吸困难、脑膜炎及关节炎等症状，发病率约6%，部分病猪后期衰竭死亡。收集临床病料经细菌分离培养、PCR鉴定和cps2J基因序列分析，确定分离到一株2型猪链球菌，命名为HNTY1。本试验研究了2型猪链球菌的流行病学特点和遗传进化关系，为更好地防控本病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病料与试验动物

试验于2019年5—10月在河南省农业科学院畜牧兽医研究所传染病研究室进行。病料来源于2019年5月河南省某规模化猪场具有疑似猪链球菌症状的断奶仔猪群，无菌采集濒死猪的脑脊液、肺脏、肝脏、心血和关节液等病料。

1.2 主要试剂

革兰氏染色液购自珠海贝索生物技术有限公司；胰蛋白胨大豆琼脂培养基（tryptic soy agar,TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（tryptic soybroth,TSB）购自Difco公司。新生牛血清购自郑州益康生物工程有限公司；微量生化试管购自杭州滨河微生物试剂有限公司；2×Taq Master Mix、DL 2 000 DNA Marker等PCR试剂购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 细菌分离纯化

将无菌采集的组织病料接种于TSA平皿（含5%新生牛血清）中，置于37℃温箱培养18～24 h，挑取TSA平皿上可疑的单个链球菌菌落进行革兰氏染色镜检，选取疑似链球菌的单菌落纯化培养后保存备用。

1.4 PCR分型

根据参考文献[12-14]设计猪链球菌保守基因gdh和荚膜多糖基因cps2J的特异性引物（表1），由上海生工生物工程有限公司合成。设立灭菌去离子水为空白对照。将纯化菌株接种于含5%新生牛血清的TSA平皿，37℃恒温培养18 h后，挑取单菌落于100 μL灭菌超纯水中，旋涡混匀，100℃煮沸10 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液提取DNA作为PCR 模板备用。 PCR 体系如下：13 μL 2×Taq PCR master mix、上下游引物各 1 μL、2 μL 模板、8 μL 超纯水。反应条件：94℃变性5 min后，94℃45 s、55℃45 s、72℃ 30 s进行35个循环，72℃延伸10 min后，4℃保存。将PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳，取阳性产物送至上海生工生物工程有限公司测序。测序结果经ClustalW算法与NCBI网站2型猪链球菌参考序列（表2）进行同源性分析，并在MEGA6.0软件使用Neighbor-Joining Method绘制系统发育进化树，Bootstrap数为1 000。

表1 猪链球菌PCR分型引物序列及相关信息

表2 构建系统进化发育树的参考菌株

2 结果

2.1 细菌形态

经24 h培养后，在含5%新生牛血清的TSA平皿上长出直径 0.2～0.8 mm、圆形、光滑、湿润、边缘整齐、半透明、灰白色略带蓝色荧光的小菌落，革兰氏染色为阳性圆形、卵圆形菌，呈单个、成对或短链状（图1）。将该菌株命名为HNTY1。

2.2 PCR鉴定

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，扩增片段与预期设计大小一致，gdh基因和cps2J基因分别在689 bp和537 bp处扩增出阳性条带，均呈阳性；PCR产物测序结果与GenBank上gdh基因和cps2J基因参考菌株的序列同源性超过99.0%，证明分离株为血清2型猪链球菌（图2、图3）。

2.3 cps2J基因序列分析

HNTY1株cps2J基因序列测定结果如下：AAAGAAGCCTATTGTATAAATACTTAAATATATGC AATTTCTTTGGAAGCGATTCATCTCCATTTTTGAAC ATTAATAAGCTATAATAAATAATATGCCACTGTAG CGTCTCTTTAAAAACAGAAAATTCATATTGTCCAC CAAATATTTTAACAAACAAATCAAAAGTTTTTTCTT CTAAATTTTCTAATTGAATAAAAA CATCTTTTTTAA ACGTATTTGTAGTACTTTGTATACCTCTTCTAGCAA AATAAAGATTTCTGTTTACATAGCTGACTTTTTTTA TATTCTTTAAATAATTTAGATTAAATAATAAGTCCT CTCCTAACCACTGTTCAGTGTCAAAACCTTTGTTTA TATATATATTCTTATAAAGTTTGCAACAAGGGCTAT TAAAGATACCGCTCATATAATGATTTGGAAAATTT TCATTTCCTAAGTCTCGCACCTCTTTTATCTCTTCCAA ATCAATTTGACACTTTtGCAGCTCAGATTCTTGATA ATTTCCATCAAAAGTAGCAAGTAACCCTCCGAC AA。

通过分子生物学软件DNAStar和MEGA6.0，将HNTY1株与另外20株国内外2型猪链球菌菌株进行序列对比和同源性分析，并绘制系统发育进化树（图4）。结果显示，与多数参考菌株相比，HNTY1株在7 bp处缺失一个T核苷酸，即缺失了天冬酰胺（Asparagine，N 或 Asn）；532 bp处缺失一个C核苷酸，即缺失了脯氨酸（Proline，P或Pro）。 HNTY1 株与上海株（SH29、Guoguang）同源性分别为99.41%和99.82%；与中国其他地区分离株（LSM102、ZYS8、05HAS68、T15、ZY05719、1827702、A7、SS12、HBLY-1、SC19） 同源性 99.4%～99.6%；与日本株（P1/7、S735、2651）同源性 99.6%；与加拿大株（90-1330、NSUI060）同源性 99.6%；与越南株BM407同源性100%；与荷兰株10同源性98.0%。

3 讨论

2型猪链球菌为高致病性人畜共患病，近年来给养猪业带来较大经济损失。猪链球菌的gdh基因非常保守，在猪链球菌的35个血清型中均存在该基因，建立gdh基因与cps2J基因的二重PCR方法，能显著提高临床2型猪链球菌鉴别的准确性[15-18]。本研究所分离的HNTY1株cps2J基因及其氨基酸序列分析表明，该分离株为2型猪链球菌，与GenBank收录的国内外大多数分离株同源性达98%以上，表明cps2J基因极度保守，不同时空猪链球菌2型无显著差异，说明这些菌株很可能具有相同起源；与NCBI收录的大多数参考株相比，HNTY1株在7 bp和532 bp处分别缺失了核苷酸T、C，即分别缺失了天冬氨酸（Asn）和脯氨酸（Pro）；与上海株guoguang相比，在461 bp处由C→T，是否2型猪链球菌出现了新的流行趋势，有待进一步研究。HNTY1株与人源猪链球菌分离株LSM102同源性达99.6%，提示2型猪链球菌对公共卫生有一定威胁性。

本试验所建立的2型猪链球菌的PCR鉴定方法及遗传进化分析，可用于猪链球菌病的流行病学调查与检测，为进一步研究2型猪链球菌病的流行病学和防控本病提供科学依据。