血清中IL-17水平及IL-17rs763780基因多态性与深圳地区Graves病患者遗传易感性分析

梁衍毅 周超阳 李春容 雷永革

(深圳市大鹏新区妇幼保健院，深圳 518120)

Graves病又称毒性弥漫性甲状腺肿(Graves′ disease，GD)是甲状腺功能亢进症中最为常见的一种涉及细胞和体液免疫紊乱的自身免疫性甲状腺疾病(AITD)之一，约占甲亢疾病的85%[1，2]。该病患者甲状腺功能明显异常，其血清甲状腺激素浓度明显升高，而促甲状腺激素(TSH)水平明显降低，但其发病机制十分复杂，有研究报导，Graves病的发生具有明显遗传倾向，遗传因素占AITD发病因素约30%[3]。近年来，国内外很多研究结论表明，Graves病的发生和发展与IL-17水平及多基因多态性突变有密切相关性[4-13]，而基因多态性突变因遗传背景和生活环境等诸多因素不同而存在很大差异，具有明显的地域性和种族性等特点。为此，本研究对深圳地区152例Graves病患者及100例健康人群的IL-17水平及IL-17rs763780基因多态性进行了调查分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1研究对象 收集2016年2月～2018年11月来深圳市大鹏新区妇幼保健院门诊或/和住院部就诊并确诊为Graves病患者152例，其中男67例，女85例，年龄15～63岁，平均(38.62±19.24)岁，均未经任何治疗，患者纳入诊断标准均符合中华医学会内分泌学分会制定的《甲状腺机能亢进症临床诊断标准》和《Graves病的诊断标准》[1]，并排除合并其他自身免疫性疾病、急性感染、慢性阻塞性肺疾病、肿瘤及既往有甲状腺疾病史患者。同时选取来医院体检中心体检的健康人群100例，其中男42例，女58例，年龄14～65岁，平均(29.03±20.67)岁，均排除既往有甲状腺疾病史及有甲状腺相关疾病家族史者。确保两组研究对象的性别、年龄等一般性资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。此研究经医院伦理委员会同意批准，所有研究对象均知情并签订知情同意书。

1.1.2仪器与试剂 ABI7500 PCR基因扩增仪由美国ABI公司提供，紫外可见凝胶成像系统、核酸分析仪由德国Eppendorf公司提供；全血基因组DNA提取试剂盒深圳亚能生物技术有限公司提供；RT-PCR试剂盒由德国QIAGEN 公司提供；IL-17试剂盒由上海基免生物科技有限公司提供。

1.2方法

1.2.1标本采集 所有研究对象均于清晨空腹采集静脉血4～5 ml，其中2 ml加入EDTA-K2一次性抗凝管内混匀，用于IL-17rs763780基因多态性分析，剩余的2～3 ml静脉血加入一次性无抗凝剂干燥管内，室温静置30 min后离心分离血清用于IL-17水平检测。

1.2.2IL-17水平测定 采用酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)检测血清中IL-17水平，所有操作均严格按照仪器、试剂盒说明书及科室的SOP操作规程进行，确保检验结果的准确性。

1.2.3DNA提取 采用深圳亚能生物技术有限公司提供的试剂盒进行提取，操作按试剂盒说明书进行，DNA提取完成后通过电泳检测其是否完整，并采用紫外分光光度仪检测其浓度以及纯度合格后，置于-20℃保存备用。

1.2.4IL-17rs763780基因多态性分析 ①引物设计：上游引物5′-GGA ATG CAA ACA AAC ACC TG-3′，下游引物为5′-GTT CCC ATC CAG CAA GAG AC-3′。②PCR扩增体系：反应总体积为20 μl，其中模板DNA 2 μl，上、下游引物各0.5 μl，2×Taq PCR Master Mix 10 μl，双蒸馏水7 μl。③PCR扩增条件：95℃预变性3 min，然后94℃ 30 s→55℃ 30 s→72℃ 30 s，如此循环35次，最后72℃延伸5 min→4℃退火。④扩增产物电泳：取5 μl PCR扩增产物在溴化己啶染色1%琼脂糖凝胶中电泳25 min。⑤对目的片段进行限制性酶切：取PCR纯化产物5 μl，Fastdigest Nia Ⅲ0.5 μl，10×Buffer 2 μl，去离子水22.5 μl，混匀于37℃ 温箱内水浴5 min。⑥基因型及等位基因频率分析：取10 μl酶切产物在溴化己啶染色1.2%琼脂糖凝胶中电泳25 min，然后观察并记录结果。

2 结果

2.1Graves组与对照组血清中IL-17水平比较 Graves组患者血清中IL-17水平为(495.47±190.52)pg/ml，明显高于对照组的(164.13±42.95)pg/ml，差异有统计学意义(t=10.627 2，P<0.05)。

2.2不同性别Graves病患者血清中IL-17水平比较 男性Graves病患者血清中IL-17水平为(427.26±152.67)pg/ml，低于女性患者的(561.73±201.63)pg/ml，差异有统计学意义(t=2.764 5，P<0.05)。

2.3电泳分析 经PCR扩增后可获得407 bp大小的目的片段，当IL-17rs763780位点T基因突变为C时则产生酶切位点，37℃水浴5 min后消化生成290 bp 和117 bp两个片段，经2%琼脂糖凝胶电泳IL-17F基因位点rs763780分别于407，290及117 bp处显色检出TT、CT及CC三种基因型带，结果见图1。

2.4PCR扩增产物酶切电泳结果 对部分抽样PCR扩增产物进行基因测序，结果见图2。

2.5Graves组与对照组IL-17rs763780基因型及等位基因频率比较 Graves病组IL-17rs763780 CC基因型及C等位基因频率分别为20.39%和34.87%，明显高于对照组，差异有统计学意义(χ2=2.810 2～3.275 6，P<0.05)，结果见表1。

图1 IL-17基因rs763780位点扩增产物电泳结果Fig.1 Electrophoresis results of amplification product of IL-17 gene rs763780Note:M is a Marker;1,2 were TT genotypes；3,4 were TC genotypes；5,6 were CC genotypes；7 was negative control；8 was the positive control.

2.6不同性别Graves病患者基因型及等位基因频率比较 男性Graves病患者IL-17rs763780 CC基因型及C等位基因频率分别为16.42%和29.10%，低于女性患者，差异均有统计学意义(χ2=2.038 4～2.615 3，P<0.05)，结果见表2。

2.7不同基因型Graves病患者血清中IL-17水平比较 IL-17rs763780 CC基因型患者IL-17水平为(549.24±197.25)pg/ml，略高于TC基因型的(524.29±193.87)pg/ml，差异无统计学意义(t=0.941 4，P>0.05)，但两者均明显高于TT基因型患者的(371.83±162.96)pg/ml，差异有统计学意义(t=2.502 1～2.871 0，P<0.05)。

图2 IL-17rs763780基因多态性测序结果Fig.2 Polymorphism sequencing results of IL-17rs763780gene

表1 Graves病组与对照组IL-17rs763780基因型及等位基因频率比较[n(%)]

Tab.1 Comparison of IL-17rs763780 genotype and allele frequency between Graves′ disease group and control group[n(%)]

GroupsnGenotype frequencyTTTCCCAllele frequencyTCGraves group15277(50.66)44(28.95)31(20.39)198(65.13)106(34.87)Control group10066(66.00)25(25.00)9( 9.00)157(78.50)43(21.50)

表2 不同性别Graves病患者IL-17rs763780基因型及等位基因频率比较[n(%)]

Tab.2 Comparison of IL-17rs763780 genotype and allele frequency between Graves′ disease patients of different genders[n(%)]

GendersnGenotype frequencyTTTCCCAllele frequencyTCMale6739(58.21)17(25.37)11(16.42)95(70.90)39(29.10)Female8538(44.71)27(31.76)20(23.53)103(60.59)67(39.41)

3 讨论

Graves病是一种常见的器官特异性自身免疫性甲状腺疾病，是甲状腺功能亢进的主要类型之一，临床主要表现为甲状腺弥散性增大和功能亢进，除导致患者甲亢症状外还常会引发一些其他疾病，最常见的为甲状腺相关眼病[14，15]，此外还会导致肝功能及肾功能损害[16,17]，严重危害人群健康。Graves病发病机理目前尚未明确，最新研究表明，遗传、环境和免疫功能紊乱等诸多因素在Graves病发病机制中起着重要作用[18]。因此，探索Graves病发病机制对Graves病的诊断、治疗及预防其并发症的发生极为必要。

IL-17是由Th17细胞亚群经TGF-β诱导分化和IL-6增强作用下所产生的一种细胞炎症因子，并参与感染性及免疫系统疾病发生和发展[19，20]。有研究报道，IL-17在许多自身免疫疾病患者的血清和组织中呈高度表达[15，16]。本研究结果显示，Graves病患者血清中IL-17水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，与国内处有关文献报道的结论相一致[15-17]，这可能与IL-17和NF-κB信号通路存在相互关系，IL-17可通过激活NF-κB信号通路诱导炎症因子的释放而参与Graves病的发生和发展等有关[17，20]。本研究结果还显示，女性Graves病患者血清中IL-17水平高于男性患者，差异有统计学意义(P<0.05)，这可能与不同性别人群的生理免疫系统结构及功能存在一定差异有关，具体原因有待进一步研究分析。

Graves病是人体内一种自身免疫性疾病，其发病机制至今尚不清楚，但大量研究表明，遗传和环境因素共同参与Graves病的发生和发展。近年来，随着全基因组关联分析认为Graves病是基因-环境交互作用的复杂疾病，国内已有很多文献表明，Graves病与多种基因的多态性突变有遗传基因易感性[8-13]。本研究结果显示，Graves病患者IL-17rs763780 CC基因型及C等位基因频率明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，与国内有关文献报道相一致，提示IL-17rs763780基因多态性可能与深圳地区Graves病的发生和发展有关，其中CC基因型及C等位基因可能是导致本地区Graves病患者发病的危险遗传基因之一。本研究结果还显示，女性Graves病患者CC基因型及C等位基因频率高于男性患者，差异有统计学意义(P<0.05)，这可能是Graves病的发病与不同性别人群中的免疫结构和功能有关，且CC和TC基因型Graves患者血清中的IL-17水平高于TT基因型患者，这可能与IL-17rs763780基因多态性突变直接或间接引起机体内免疫功能紊乱导致Th17细胞亚群诱导TGF-β加速分化和增强IL-6细胞因子作用等有关，具体作用机制有待研究。

综上所述，IL-17水平在Graves病患者血清中呈高度表达，IL-17rs763780 CC基因型及C等位基因频率明显高于健康人群，且女性高于男性，说明IL-17rs763780基因多态性与Graves病的发生和发展可能有密切相关性，但不同地区和种族人群的基因多态性突变情况存在很大差异。因此，对Graves病相关基因多态性进行调查分析，对阐明Graves病的发病机制、诊断及治疗具有重要意义。