皖北地区1 025例孕妇抗-HPA抗体的初步研究①

张 军 王彩莲 陈 丽 陆褚楚

(蚌埠医学院第一附属医院输血科，蚌埠 233004)

新生儿同种免疫性血小板减少症(neonatal alloimmune thrombocytopenia,NAIT)是由于母亲对胎儿不相容的HPA产生同种血小板抗体，通过胎盘输入胎儿致使胎儿血小板被致敏清除，从而引起胎儿血小板减少的一种疾病[1]。该病在高加索人群中的发病率约为0.10%，其抗体主要为针对HPA-1a的抗体，在日本人群中发病率约为0.15%，其抗体主要为针对HPA-5b的抗体[2，3]。对抗-HPA抗体阳性孕妇，可于孕12～20周静注IgG或在后期结合激素治疗来预防NAIT的发生[4]。对于产后NAIT新生儿，视其血小板计数结果和临床症状的严重程度进行静脉IgG注射或血小板输注治疗[4，5]。由于不同地区之间血小板表面抗原HLA及HPA的抗原表型频率相差很大，导致不同地区血小板抗体的产生情况、抗体抗原特异性以及NAIT的发病情况也存在着很大的差异；而目前中国人群孕妇关于血小板抗体(包括抗-HLA抗体和抗-HPA抗体)的阳性率、NAIT的发病情况及抗体阳性孕妇所产新生儿罹患NAIT的比例等基线数据仍为空白，现有国外的数据无法指导是否需要在我国开展孕妇血小板抗体产前筛查项目。因此，本研究对皖北地区孕妇孕期血小板抗体产生情况进行检测分析，为评价我国孕妇产前进行血小板抗体筛查的必要性提供基础数据和统计学依据。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1研究对象 选取2016年12月至2017年12月在我院进行产检的孕12～40周孕妇 1 025例，年龄18～44岁，初次妊娠者410例，年龄18～34岁，多次妊娠者615例，年龄22～44岁，其中有2次妊娠史者388例，3次妊娠史者188例，4次及以上妊娠史者89例。所有孕妇均签署书面知情同意书，并记录孕妇产检时的血小板计数。

1.1.2试剂与仪器 MASPAT血小板抗体检测试剂盒购自荷兰Sanquin公司(8000236956、8000240957、8000243453)，GTI血小板抗体检测试剂盒(3005907)购自北京博富瑞基因诊断技术有限公司，人类血小板同种抗原HPA基因分型试剂盒(201709005)、HLA-ABDRDQ基因分型中分辨测定试剂盒(201709005)购自天津秀鹏生物技术开发有限公司，核酸提取试剂盒购自天隆科技有限公司，琼脂糖购自西班牙BIOWEST公司。酶标仪购自美国BioTek公司，洗板机购自济南康堃医疗器械有限公司，普通PCR仪(ABI9700)购自美国ABI公司，电泳仪(JY300C)购自北京君意东方电泳设备有限公司，电泳槽(JY-SP3)购自北京君意东方电泳设备有限公司，凝胶成像系统(GenoSens1860)购自上海勤翔科学仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1标本制备 采集孕妇的外周静脉血于EDTA抗凝采血管中，4 000 r/min离心10 min，用一次性移液管将血清移入EP管，血细胞保存于真空采血管中，EP管和真空采血管置于-86℃冰箱中保存。

1.2.2血小板抗体筛查 ①使用前将所有试剂恢复至室温。②操作按照试剂盒说明书进行。③目视判读结果。指示红细胞弥散分布于反应孔底部为阳性，表明血清中存在血小板抗体；指示红细胞聚集在反应孔底部中央为阴性，表明血清中不存在血小板抗体。④对于阳性标本需重复上述实验，并按照说明书用二磷酸氯喹破坏血清中的HLA抗体，然后对结果判读：指示红细胞弥散分布于反应孔底部为阳性，表明血清中存在抗-HPA抗体；指示红细胞聚集在反应孔底部中央为阴性，表明血清中不存在抗-HPA抗体。

1.2.3血小板抗体抗原特异性检测 ①用去离子水10倍稀释洗脱液(1倍体积Conc.Wash+p倍体积去离子水)，混匀，每个微孔加250 μl稀释后的洗脱液，室温静置10 min，甩干，倒扣于吸水纸上;②用稀释液SD按照3∶1比例稀释阴阳性对照、患者血清。在阳性对照孔、阴性对照孔及患者血清孔中分别加入50 μl稀释后的阳性对照试剂、阴性对照试剂及患者血清，封膜，37℃水浴30 min，取出甩干，洗脱液洗板4次，最后1次结束后倒扣于吸水纸上；③用稀释液SD按照100∶1比例稀释抗-IgG(3 000 μl∶30 μl)，混匀，除去空白孔，每孔中加50 μl已稀释的抗-IgG,封膜，37℃水浴30 min，取出甩干，洗板4次；④用0.5 ml去离子水溶解1瓶PNPP粉末，然后用底物缓冲液100∶1(6 000 μl∶60 μl)稀释，除空白孔，每孔加100 μl已稀释的PNPP，室温(22～25℃)避光静置30 min；⑤空白孔加200 μl终止液，其余孔加100 μl终止液；酶标仪405 nm读值，490 nm为参照波长。结果判断：(阴性对照孔的均值)×2=Cutoff 值，OD≥Cutoff 值即被判定为阳性。

1.2.4DNA提取及PCR-SSP法检测HLA、HPA基因型 ①DNA 的提取：冻存血室温下溶解，振荡混匀10 s，采用DNA提取试剂盒(201706002)从全血样本中提取基因组DNA,具体操作过程详见试剂说明书。②HLA、HPA基因型：使用秀鹏生物HLA-ABDRDQ基因分型中分辨测定试剂盒在PCR仪器上对基因组DNA进行扩增，HLA基因与HPA基因扩增参数如下：96℃ 2 min，96℃ 20 s，68℃ 60 s，96℃ 20 s，65℃ 50 s，72℃ 45 s，96℃ 20 s，55℃ 45 s，72℃60 s，72℃ 3 min，共37个循环，4℃保存。扩增结束后，使用2.5%琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳(150 V，10～15 min )。电泳结束后使用凝胶成像系统观察电泳结果，并根据试剂盒读板纸对电泳结果进行解读。

1.3统计学分析 采用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1血小板抗体筛查结果分析 在1 025例孕妇中血小板抗体阳性者共45例，总阳性率为4.39%，其中41例为抗-HLA抗体阳性，4例为抗-HLA抗体和抗-HPA抗体同时阳性，抗-HLA抗体阳性率为4.39%，抗-HPA抗体阳性率为0.39%。45例血小板抗体阳性孕妇年龄在25～44岁，妊娠次数1～5次，均未有血小板输注史、血小板减少病史及自身免疫性疾病病史，其中有2例孕妇因为贫血有悬浮红细胞输注史。4例抗-HPA抗体阳性孕妇年龄均≥38岁，妊娠次数均≥3次，无血小板减少患儿生产史，在此4例孕妇中仅有1例被确定为抗-HPA-5b抗体阳性，该孕妇年龄41岁，此次为第4次妊娠，顺产1次，流产2次，无输血史、血小板减少病史及自身免疫性疾病病史。

2.2血小板抗体的产生与妊娠次数相关性分析 初次妊娠孕妇与多次妊娠孕妇血小板抗体阳性率比较，初次妊娠孕妇共410例，血小板抗体阳性者6例，阳性率为1.46%；多次妊娠孕妇共615例，血小板抗体阳性者39例，阳性率为6.34%。两组数据比较，差异具有统计学意义(χ2=13.95，P<0.05)。见表1。妊娠次数与血小板抗体阳性率比较在有多次妊娠史孕妇中，有2次妊娠史者388例，血小板抗体阳性者18例，阳性率为4.64%；3次妊娠史者138例，阳性者10例，阳性率为7.25%；4次及4次以上者89例，阳性者11例，阳性率为12.36%。三组数据比较，差异具有统计学意义(χ2=7.51，P<0.05)。见表2。

2.3抗-HLA抗体阳性孕妇HLA-A、B、DR、DQ基

表1 初次妊娠与多次妊娠孕妇血小板抗体阳性率比较

Tab.1 Comparison of platelet antibody positive rate in pregnant women with first pregnancy and multiple pregnancies

GroupsPositiveNegativeTotalPositive rate(%)First pregnancy64044101.46Multiple pregnancies395766156.34Total459801 0254.39

表2 血小板抗体阳性率与妊娠次数相关性比较

Tab.2 Comparison of relationship between platelet antibody positive rate and pregnancy frequency

Number ofpregnanciesPositiveNegativeTotalPositiverate(%)2183703884.643101281387.25≥411788912.36Total395766156.34

图1 琼脂糖电泳图Fig.1 Photographa of agarose electrophoresisNote: A.Sample hole;B.Internal parameter quality control hole;C.Positive typing hole;D.Primer dimer;Lane 1,3,7.Positive results;Lane 2,4,5,6,8.Negative result.

因分型结果 在抗-HLA抗体阳性孕妇的HLA-A、B、DR、DQ基因分型结果中，见图1、2。共检出HLA特异性抗原位点53个，见表3。其中检出HLA-A特异性抗原位点12个，频率较高的特异性抗原有A2(0.274 2)、A24(0.225 8)、A11(0.145 2)、A33(0.112 9)，HLA-B特异性抗原位点22个，频率较高的为B46(0.129 0)、B13(0.112 9)、B60(0.112 9)、B62(0.112 9)和B58(0.096 8)，HLA-DQ特异性位点7个，频率较高的有DQ6(0.241 9)、DQ2(0.161 2)、DQ9(0.161 2)、DQ5(0.145 2)、DQ7(0.145 2)，HLA-DR特异性位点12个，频率较高的有DR9(0.161 2)、DR4(0.145 2)、DR15(0.129 0)、DR7(0.096 8)、DR12(0.096 8)、DR13(0.096 8)。

2.4抗-HPA抗体阳性孕妇的HPA1-17基因分型结果 在4例抗-HPA抗体阳性孕妇中，有3例孕妇HPA1-17基因型组合为HPA-(1,2,4-14,16,17)aa-3ab-15ab(见图3,其中HPA15扩增孔中的高分子量条带为参考基因，低分子量条带为目的基因)，1例为HPA-(1, 2, 4-14,16,17)aa-3aa-15aa。其中确定抗-HPA-5b抗体阳性孕妇的HPA1-17基因型组合为HPA-(1,2,4-14,16,17)aa-3ab-15ab。

2.5关于新生儿NAIT的发病情况 在随后对1 025例孕妇的随访中，通过对新生儿出生后血小板计数情况(血小板计数均<150×109L-1)或者临床表现(皮肤黏膜有瘀点、瘀斑或有颅内出血)的观察，未发现有新生儿发生NAIT。

图2 HLA-A、B、DR、DQ基因分型琼脂糖电泳图Fig.2 Photographa of HLA-A，B，DR，DQ genotype agarose electrophoresisNote: HLA genotypes is A11/A24/B48/B54 DQ5/DQ9/DR9/DR14 accoding to the formula in the instruction.

表3 皖北地区抗-HLA抗体阳性孕妇HLA-A、B、DR、DQ抗原频率

Tab.3 HLA-A，B，DR，DQ antigen′s frequency of anti-HLA antibody positive pregnant women in North of Anhui Province

AntigenLocusFrequencyAntigenLocusFrequencyAntigenLocusFrequencyA2170.274 2B4510.016 1DQ590.145 2A320.032 2B4680.129 0DQ6150.241 9A1190.145 2B4820.032 2DQ790.145 2A1310.016 1B5010.016 1DQ850.080 6A2310.016 1B5120.032 2DQ9100.161 2A24140.225 8B5210.016 1DR120.032 2A2620.032 2B5420.032 2DR490.145 2A3040.064 5B5520.032 2DR760.096 8A3110.016 1B5710.016 1DR840.064 5A3220.032 2B5860.096 8DR9100.161 2A3370.112 9B6070.112 9DR1130.048 3A6820.032 2B6120.032 2DR1260.096 8B710.016 1B6270.112 9DR1360.096 8B810.016 1B6310.016 1DR1420.032 2B1370.112 9B6510.016 1DR1580.129 0B3530.048 3B7530.048 3DR1620.032 2B3810.016 1DQ2100.161 2DR1740.064 5B4420.032 2DQ440.064 5---

图3 HPA1-17基因分型琼脂糖电泳图HPA基因型为HPA-(1,2,4-14,16,17)aa-3ab-15abFig.3 Photographa of HPA1-17 genotype agarose electrophoresisHPA genotype is HPA-(1,2,4-14,16,17) aa-3ab-15ab

3 讨论

在本次研究的1 025例孕妇中，血小板抗体阳性率为4.39%，阳性率低于国内相关报道(8.1%)[6]，考虑原因可能有两点：一是在本研究中孕妇孕龄为12～40周，部分孕龄较小的孕妇可能还未产生血小板抗体，二是可能存在人群地域之间的差别。但本研究中有多次妊娠史孕妇血小板抗体的阳性率明显高于初次妊娠孕妇，并且随着妊娠次数的增加，血小板抗体阳性率明显增高，这与国内报道结果是一致的[7]。对于血小板抗体初筛阳性的45例标本，我们用二磷酸氯喹预处理血小板抗原以除去HLA的作用后[8]，重复进行初筛试验，血小板抗体仍为阳性(即抗-HPA抗体阳性)的有4例，抗-HPA抗体阳性率为0.39%，该4例孕妇妊娠次数均在3次及以上，后通过随访发现，该4例孕妇所产新生儿并未发生血小板减少，考虑有两点原因，一是因为母体转运IgG类抗体时受到胎儿Fc受体调节所致[9]，二是可能与抗-HPA抗体滴度较低有关，也有研究显示，在白种人中最具免疫原性的抗原是HPA-1a中，但也只会使10%的HPA-1bb母亲致敏，因此并不是所有胎母HPA抗原不合和抗-HPA抗体都导致新生儿发生NAIT[10,11]。为明确4例抗-HPA抗体阳性孕妇是否同时伴有抗-HLA抗体阳性并确定抗-HPA抗体抗原特异性，4例标本采用抗原捕获酶联免疫吸附试验用一组已知表型的血小板抗原对待测血小板抗体进行筛检后发现，4例标本都同时伴有抗-HLA抗体阳性，这与文献中提到的抗-HPA抗体单独存在的频率较低而常与抗-HLA抗体共同存在的现象一致[12]。值得提出的是，4例抗-HPA抗体阳性标本用此方法检测后抗-HPA抗体阳性者反而只有1例，为抗-HPA-5b抗体，考虑是因为GTI血小板抗体检测试剂盒虽可鉴定血小板抗体抗原特异性，但该试剂盒中血小板抗原只包括HPA-1,3,4,5和HLA-I，并没有包含目前发现的所有35种HPA，尤其是比较常见的HPA-2,15。该例抗-HPA-5b抗体阳性孕妇的HPA1-17基因型为HPA-(1,2,4-14,16,17)aa-3ab-15ab，因此考虑该抗体是孕妇针对胎儿遗传自父亲的不相容同种异体抗原HPA-5b产生的，但遗憾之处是并没有对胎儿及其父亲做HPA基因分型。很多文献报道，同属亚洲人群的日本人群中导致NAIT发生的主要是抗-HPA-5b抗体，因此，我们也有理由假设在皖北地区人群中甚至中国人群中致NAIT发生的致病抗体可能为抗-HPA-5b抗体。在对山东汉族人群的HLA-A、B的基因分型中[12]，频率较高的抗原为A2、A11、A24、A33、B13、B61、B62，这与本次研究中血小板抗体阳性孕妇的HLA-A、B基因分型结果一致，由于本次研究并没有检测皖北地区血小板抗体阴性孕妇及非孕妇普通人群的HLA基因分型作为对照，因此，我们只能猜测，抗-HLA抗体阳性孕妇的HLA基因分型可能和普通人群一样，抗-HLA抗体的产生与孕妇HLA基因分型可能没有关系。

总之，孕妇妊娠次数越多，血小板抗体产生的机率就越大，因此血小板抗体筛查在孕妇日常产检中也应当发挥巨大的作用[13]，尤其是对于有多次妊娠史和输血史、反复流产、血小板输注无效和产过患血小板减少症患儿的孕妇[14]，可于妊娠第16周至第28周筛查血小板抗体并监测血小板抗体变化情况[15],它能够有效地探讨反复流产的病因、早期预测及预防新生儿同种免疫性血小板减少症的发生，对于抗-HPA抗体阳性的孕妇，应引起医生及孕妇的高度重视，可于孕12～20周时静脉注射丙种免疫球蛋白或在孕后期结合激素治疗来预防NAIT的发生[16,17]，国外也曾报道过通过体外受精成功避免NAIT发生的案例[18]。若产后新生儿发生血小板减少症，应视其血小板计数结果和临床症状的严重程度进行静脉丙种免疫球蛋白注射或血小板输注治疗[19]。诊断NAIT时需要对孕妇血清中的抗-HPA抗体进行鉴定，并对母子之间的HPA抗原是否相容进行分析[20,21]。有条件的医院可以应用分子生物学技术进一步对患儿及其父母进行HLA及HPA基因分型检测，根据相应的抗原进行抗体特异性分析，以明确病因及指导临床治疗。同时我们也建议育龄期妇女在孕前进行血小板抗体的筛查，评估由于血小板抗体引起的早期流产和NAIT的发生概率，确保优生优育。

虽然NAIT及血小板血型已经得到越来越多人的关注，但都是由于生产过患有该病的新生儿后才被重视[22]，目前多数国家都没有开展对该病的筛查工作和对该病的风险评估，这可以成为妇产科、儿科及输血科共同的研究方向。文献报道，在亚洲人口中与免疫介导的血小板减少有关的最重要的血小板抗体是抗-HPA-3抗体和抗-HPA-4抗体[23]，其中并未包括我国，而目前我国只是部分地区建立了血小板HLA和HPA基因型资料库[12,24-26]，其抗原基因型都有区域性分布特征。虽然国内外对不同群体的 HPA 和 HLA 分布已有较多研究,但因 HPA和 HLA 基因分布在不同种族、不同民族甚至同一民族的不同人群中各不相同,具有临床意义的抗原也不尽相同,故仍有必要了解各个地区的 HPA和 HLA 分布频率,并藉此建立本地化的血小板供者资料库。因此每个地区都应调查本地区HLA和HPA基因型分布特征，掌握本地区的优势同种抗原及高危抗原系统，针对特殊人群如孕妇、患有自身免疫性血小板减少症的患者进行血小板抗体筛查，同时建立本地区血小板捐献者HLA 和HPA基因型资料库，以便能达到HLA血型和HPA血型均匹配的血小板输注治疗，这样可以减少血小板输注无效的发生，孕妇及伴有血小板减少的患者能及时、有效地输注血小板制剂，节约医疗资源，提高临床治疗效果，更有重要的免疫学意义和社会效益。