骨髓调节性T细胞在脑梗死患者的表达及与预后的相关性研究①

王 浩 张天宇 滕艳萍 郑宵阳 许德超

(齐齐哈尔医学院附属第二医院神经内科，齐齐哈尔 161000)

根据世界卫生组织报告脑梗死已经成为全世界死亡的第二位原因，且全世界至少有1/6患者遭受一次脑梗死[1]。近年来，随着现代科技的不断发展，虽然脑梗死死亡率得到下降，但是其发病率呈上升趋势，成为人类功能障碍的主要原因[2]。临床上，根据脑梗死发病机制分为脑血栓形成、腔隙性脑梗死与脑栓塞三种不同类型，且发病早期以脑实质损伤为主，而后期以肺部感染为主，不仅会增加蛀牙时间，亦可增加临床死亡率[3]。因此，积极寻找、开发新的治疗靶点对改善脑梗死患者预后具有重要意义。临床研究表明：脑梗死能引起神经元死亡，导致小胶质细胞活化，造成机体免疫系统发生变化，并且上述变化又能影响脑实质及机体气体细胞的变化[4]。对于正常人而言，免疫系统主要由骨髓、胸腺中枢免疫器官和脾脏、淋巴结等外周器官组成[5]。而脾脏是最大的免疫器官，当脑梗死发生后则能激活脾脏内淋巴细胞，促使其迁移到外周及梗死病灶周围，分泌大量的炎症介质，进一步扩大梗死体积，影响神经功能的发挥[6]。因此，切除脾脏有助于改善脑梗死患者神经缺损症状，最大限度保护脑功能，但是尚需进一步验证[7]。

骨髓是所有免疫细胞分化、发育的重要场所，亦是造血干细胞、调节性T细胞、内皮祖细胞的“仓库”[8]。脑梗死发生后，骨髓中CD4+、CD8+T细胞水平将会升高，但是脑梗死后72 h骨髓中B细胞数量则会下降。同时，骨髓能通过生成、释放上述细胞成分参与脑梗死的发生、发展。调节性T细胞是骨髓细胞的重要组成部分，占骨髓CD4+细胞的1/3，其比例为所有淋巴器官最高者[9]。临床研究表明[10]：调节性T细胞与其他T淋巴细胞相比其特异性蛋白为叉头样转录因子3(FoxP3)，其表达水平决定了Treg的免疫能力，且骨髓中Treg细胞表达FoxP3水平为外周血Treg细胞的两倍。由此看出骨髓调节性T细胞从数量、功能对机体免疫系统的维持均具有重要意义。但是，骨髓调节性T细胞在脑梗死患者中的表达与预后的相关性研究较少[11]。因此，本文采用随机对照方法进行研究，探讨骨髓调节性T细胞在脑梗死患者中的表达及与预后的相关性，报道如下。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1临床资料 选择2017年5月～2018年3月附属神经内科治疗的脑梗死患者78例作为对象，设为观察组，男45例，女33例，年龄41～78岁，平均(61.25±4.27)岁；发病时间1～12 h，平均(5.25±0.61)h。疾病严重程度：轻度24例，中度30例，重度24例。合并症：高血压35例，高血脂20例，糖尿病19例。选择同期治疗的骨髓穿刺者61例，设为对照组，男41例，女20例，年龄40～79岁，平均(60.77±4.21)岁。本研究获得医院伦理委员会批准，对患者及家属进行常规宣教、签署知情同意书，两组临床资料均无统计学意义(P>0.05)。

1.1.2纳入及排除标准 纳入标准：①均符合第四届脑血管病会议制定的脑梗死诊断标准[12]，均经颈部血管超声检查最终确诊；②观察组均符合阿托伐他汀药物治疗适应证，且患者均能耐受；③能遵医嘱完成有关检查、诊断。排除标准：①合并其他心血管系统疾病、恶性肿瘤或病历资料不全者；②近3个月使用其他方法治疗或对本研究结果产生影响者；③合并凝血功能异常、精神异常或伴有自身免疫系统疾病者。

1.1.3仪器与设备 FACS Calibur型流式细胞仪(美国BD公司)、Ficoll分离液(天津市灏洋生物制品有限公司)、鼠抗人CD4-异硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体、高速冷冻离心机(德国赛多利斯公司)、IL-10、TGF-β1酶联免疫吸附试验(美国罗氏生物科技有限公司)、酶标仪(瑞士梅特勒-托利多公司)、全自动生物化学分析仪、全自动血液分析(日本奥林巴斯有限公司)。

1.2方法

1.2.1骨髓调节性T细胞表达 ①标本采集。观察组与对照组入院后均抽取骨髓抗凝血4 ml，2 ml抗凝血采用Ficoll分离液分离，获得外周血单个核细胞(PBMC)，调整细胞密度为2×109L-1，用于Treg细胞测定；取2 ml抗凝血，10 min离心，离心力1 638 g，血清分离后放置在-80℃冰箱中，备用[13]。②骨髓调节T淋巴细胞水平测定。采用流式细胞术(FCM)检测两组骨髓中Treg所占CD+T细胞数的百分比。取上述分离的骨髓标本，10 min离心，离心力1 453 g，去除上层清液，加入磷酸盐缓冲液200 μl重悬细胞。在试管中分别加入鼠抗人CD4-FITC单抗、CD25-APC单抗与CD127-PE单抗。在同型对照管中加入同型对照抗体，常温下避光孵育15 min；加入PBS 2 ml洗涤后10 min离心，离心力1 835 g，去除上层清液，利用PBS 500 μl完成细胞重悬，上机检测[14]。③IL-10、TGF-β1水平测定。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)完成两组IL-10、TGF-β1浓度测定。取96孔板，设置标准品孔与待测样品孔，取获得的骨髓标本2 ml，放置在待测标本孔中，加入样本稀释液40 μl到50 μl，在标准品孔中加入不同浓度标准品50 μl；加入辣根过氧化物标记的抗体100 μl，37℃恒温进行60 min孵育，洗板，去除过多的洗涤液，滤纸上拍干，连续重复5次，然后向每孔中加入底物A、B各50 μl，37℃恒温进行15 min 孵育，最后向每孔中加入终止液50 μl终止反应，在酶标仪492 nm处完成吸光度值测定，绘制标准曲线，计算IL-10、TGF-β1水平[15,16]。

1.2.2治疗及与预后的相关性 观察组患者均给予常规方法治疗，包括：脱水、改善循环、抗血小板、清除自由基等基础治疗；根据阿托伐他汀剂量分为高剂量组与低剂量组。高剂量组每次取阿托伐他汀片(北京嘉林药业股份有限公司，国药准字H20093819)40 mg，每晚口服1次，低剂量组每次取阿托伐他汀片20 mg，每晚1次，治疗1个月后评估疗效，完成患者骨髓调节性T细胞测定(检测方法同上)[17]。

2 结果

2.1观察组与对照组Treg细胞、IL-10、TGF-β1水平比较 观察组脑梗死患者骨髓中Treg所占CD+T细胞数的百分比、IL-10及TGF-β1水平，均低于对照组(P<0.05)，见表1。

2.2观察组不同疾病严重程度Treg细胞、IL-10、TGF-β1水平比较 观察组脑梗死患者中轻度患者骨髓中Treg所占CD+T细胞数的百分比、IL-10及TGF-β1水平，均高于中度与重度患者(P<0.05)；中度患者骨髓中Treg所占CD+T细胞数的百分比、IL-10及TGF-β1水平，均高于重度患者(P<0.05)，见表2。

2.3高剂量组与低剂量组Treg细胞、IL-10、TGF-β1水平比较 观察组中高剂量组45例，低剂量组33例，高剂量组Treg细胞、IL-10、TGF-β1水平，均高于低剂量组(P<0.05)，见表3。

2.4骨髓调节性T细胞与脑梗死患者预后相关性分析 脑梗死患者治疗后进行6个月随访，23例患者死亡，55例患者取得良好预后。SPSS Pearson相关性分析结果表明：脑梗死患者治疗预后与Treg细胞、IL-10、TGF-β1水平均呈正相关性(P<0.05)，见表4、图1。

GroupsnTreg(%)IL-10(ng/L)TGF-β1(ng/L)Observation group783.15±0.6930.14±4.5193.41±7.92Control group6111.48±2.1278.57±5.89212.59±15.83t-29.491 153.175 153.773 1P-0.0000.0000.000

Severity of diseasenTreg(%)IL-10(ng/L)TGF-β1(ng/L)Mild249.45±2.091)2)64.78±3.251)2)189.46±11.321)2)Moderate303.15±0.642)30.14±4.512)93.41±7.982)Severe242.64±0.5125.31±2.9880.45±5.71

Note：Compared with severe patients,1)P<0.05;compared with moderate patients,2)P<0.05.

GroupsnTreg cells(%)IL-10(ng/L)TGF-β1(ng/L)High dose group4510.59±2.1569.42±3.51196.84±13.24Low dose group337.31±2.0145.63±2.16132.39±10.39t-6.912 636.922 024.074 7P-0.0000.0000.000

表4 骨髓调节性T细胞与脑梗死患者预后相关性分析(r，P)

Tab.4 Analysis of prognosis between bone marrow regulatory T cells and patients with cerebral infarction(r，P)

CorrelationTreg(%)IL-10(ng/L)TGF-β1(ng/L)r0.6830.7910.668P0.0390.0180.031

图1 脑梗死治疗预后与骨髓调节性T细胞相关性Fig.1 Correlation between prognosis of cerebral infarction and bone marrow regulatory T cells

3 讨论

脑梗死是临床上常见的心血管系统疾病，且根据其发病机制形成了多种学说：脂质浸润学说、血管内血栓形成学说、慢性免疫炎症反应损伤学说等[19]。目前，普遍认为脑梗死的发生、发展与炎症介质、免疫水平等有关，能始终贯穿于脑梗死的全过程。临床研究表明[20]：脑梗死能激活交感神经系统，促使支配骨髓的交感神经纤维增强，从而释放大量的去钾肾上腺素。同时，持续增加的去甲肾上腺素能直接作用于骨髓细胞表面，促进前列腺素2(PGE2)的表达与分泌；PGE2能刺激淋巴表面的EP4，可诱导淋巴细胞的分泌，造成树突状细胞表达水平升高，从而引起骨髓调节性T淋巴细胞水平下降[21]。本研究中，观察组脑梗死患者骨髓中Treg所占CD+T细胞数的百分比、IL-10及TGF-β1水平，均低于对照组(P<0.05)，说明骨髓调节性T淋巴细胞水平在脑梗死患者中呈低表达，能参与疾病的发生。对于正常人而言，骨髓位于骨骼腔内，占机体体重的4%～6%，属于造血系统、免疫系统的重要组成部分，由造血干细胞、免疫细胞构成。当机体内环境发生变化(如发生脑梗死)时，骨髓可以通过调控造血干细胞分化直接参与外周免疫的调控，从而对外周免疫反应产生影响。同时，骨髓亦可以释放骨髓内NK细胞、单核细胞及Treg等细胞直接参与外周免疫的调控，且上述免疫既可以是机体固有免疫，亦可以为适应性免疫反应。本研究中，观察组脑梗死患者中轻度患者骨髓中Treg所占CD+T细胞数的百分比、IL-10及TGF-β1水平，均高于中度与重度患者(P<0.05)；中度患者骨髓中Treg所占CD+T细胞数的百分比、IL-10及TGF-β1水平，均高于重度患者(P<0.05)，说明骨髓调节性T细胞能反应患者的疾病严重程度，直接参与疾病发展。骨髓调节性T细胞是人体重要的免疫抑制细胞，能抑制免疫细胞的增殖与分泌功能，避免适应性免疫的过度分化。国外学者研究了脑梗死对于骨髓调节性T细胞数量的影响，结果表明脑梗死患者发病1 d后骨髓调节性T细胞数量明显减少，与本研究结果相符，进一步明确了脑梗死对于免疫系统的影响。

急性脑梗死是由于各种原因引起脑部血液循环障碍，脑部血流急剧减少，脑组织发生缺血、缺氧性病变，从而产生相应的神经功能缺损。急性脑梗死病因复杂，而脑梗死后脑损伤是造成患者疾病加重的主要原因。本研究中，以阿托伐他汀作为治疗药物，分析不同剂量阿托伐他汀治疗急性脑梗死患者预后，结果表明：观察组中高剂量组45例，低剂量组33例，高剂量组Treg细胞、IL-10、TGF-β1水平，均高于低剂量组(P<0.05)，说明阿托伐他汀用于急性脑梗死患者中能获得良好的治疗效果，且患者预后与阿托伐他汀呈剂量依赖性。阿托伐他汀属于羟甲基戊二酰酶A还原酶抑制剂，属于临床常用的调脂制剂，能抑制TC的合成。现代药理结果表明脑梗死患者给予阿托伐他汀类药物有助于改善脑卒中结局，能改善脑梗死结局，降低死亡率。临床研究表明阿托伐他汀具有抗动脉粥样硬化，改善脑梗死患者结局，发挥抗炎、免疫调节活性作用。同时，阿托伐他汀能抑制Th1表达，促进Th2表达，纠正急性脑梗死患者Th17/Treg失衡。国外学者临床研究表明脑梗死患者给予阿托伐他汀治疗后免疫水平得到明显改善，且高剂量阿托伐他汀治疗效果更加，能提高Treg频率，纠正机体Th17/Treg失衡，且该效应在脑梗死早期产生。临床研究表明：阿托伐他汀属于是一种HMG-CoA还原酶选择性、竞争性抑制剂，能降低血浆胆固醇、脂蛋白水平，亦可增加肝脏细胞表面的LDL受体，提高低密度脂蛋白的摄取、分解。为了进一步分析骨髓调节性T细胞与脑梗死患者治疗预后，本研究中对二者进行相关性分析，结果表明：脑梗死患者治疗后进行6个月随访，23例患者死亡，55例患者取得良好预后。SPSS Pearson相关性分析结果表明脑梗死患者预后与Treg细胞、IL-10、TGF-β1水平均呈正相关性(P<0.05)，由此看出阿托伐他汀用于脑梗死患者中能获得良好的治疗预后，且与骨髓调节性T细胞存在明显的相关性。因此，脑梗死患者治疗过程中加强骨髓调节性T细胞水平测定能评估患者预后，治疗时可加强患者骨髓调节性T细胞测定结果调整治疗方案，使得患者的治疗更具科学性。

综上所述，骨髓调节性T细胞在脑梗死患者中呈低表达，能参与疾病发展，且与预后呈正相关性，给予高剂量阿托伐他汀有助于改善患者预后，调节骨髓调节性T细胞水平。但是，本研究中亦存在诸多局限性，一方面实验中纳入病例数相对较少，需要大样本量进一步验证；另一方面对患者完成数据统计、分析时，存在较大的人为误差，均需要进一步分析与研究。