巨噬细胞参与伤口愈合和组织再生的研究进展①

姜 琦 李京蔓 侯亚义

(南京大学医学院，南京 210093)

巨噬细胞作为一种重要的免疫细胞，能够在伤口局部大量浸润，并在伤口愈合过程中发挥关键作用[1]。分化的伤口处，巨噬细胞可作为多种表型存在，且呈复杂动态变化及分泌不同种类的细胞因子，从而调控伤口愈合和疤痕形成。由于巨噬细胞几乎存在于所有组织中，不同组织的伤口修复过程可能具有相似性[2]，由此可以通过巨噬细胞的共同点和特征性将不同组织的修复及愈合相联系。本文就巨噬细胞参与伤口愈合和组织再生的研究进展进行综述，并提出与巨噬细胞相关的组织再生策略，基于此可能会对子宫损伤修复提出新的解决方案。

1 巨噬细胞及其表型

巨噬细胞是具有多种功能的免疫细胞，在先天性免疫和获得性免疫中均发挥重要作用。巨噬细胞能够通过吞噬作用清除细胞碎片、中性粒细胞、入侵生物体和其他凋亡细胞，除此之外，它还积极调节组织愈合过程[3]。为了执行该功能，巨噬细胞在伤口愈合过程中发展出不同的表型。

伤口处的巨噬细胞是一个异质性细胞群，最常用的分类方法是根据免疫应答中巨噬细胞活化方式的不同将巨噬细胞分为两类，第一类是经典激活的巨噬细胞，为M1促炎表型，对细菌、IFN-γ、细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和TNF-α有响应[4,5]；第二类是替代性激活的巨噬细胞，为M2抗炎表型，对IL-4、IL-13和IL-33有响应[6]。

M1型巨噬细胞能产生大量促炎细胞因子，如TNF-α和IL-6以及其他促进伤口愈合初始阶段的物质，它们具有高度的吞噬功能，能够吞噬凋亡的中性粒细胞，并且清除伤口中的病原体或碎片[7]。M2型巨噬细胞具有抗炎作用，可通过IL-4、IL-13或凋亡的中性粒细胞进行体外诱导分化产生，它们能够调节血管再生、成纤维细胞再生、肌成纤维细胞分化和胶原生成[7,8]。除了经典的M1-M2分类系统之外，Murray等[9]提出了新的巨噬细胞分类系统，根据相应的激活物进行命名，即M(IFN-γ)、M(IL-4)和M(IL-10)等。

目前，对于不同的伤口巨噬细胞亚群的成因还存在争议，主要有以下三种观点：第一种观点认为，巨噬细胞可能来源于不同时期招募的具有不同表型的单核细胞，这些单核细胞可分化为具有不同表型的巨噬细胞；第二种观点认为单核细胞可能在伤口愈合过程中的不同时间被招募，在伤口愈合过程中，不断变化的伤口微环境会影响到它们的极化；第三种观点认为M1巨噬细胞可能受局部伤口环境的影响从而分化成M2巨噬细胞[10]。许多研究支持第三种观点，认为参与调节早期炎症功能和后期伤口修复功能的是同一群巨噬细胞[10]，这表明伤口局部环境的变化会导致巨噬细胞表型的转变。然而，并非所有巨噬细胞都适合M1-M2表型的分类标准。最近的研究表明，巨噬细胞的功能不局限于以前的定义，还涉及电传导、铁循环、肌成纤维蛋白转化和突触修剪等[11-15]。巨噬细胞功能受体液免疫微环境的高度影响，传统表型分类和分子标记可能不足以充分确定它们在体内的动态作用和行为。可见，我们需要对巨噬细胞的形态、迁移模式及其相邻细胞组成进行综合考虑，以获得对巨噬细胞功能的整体理解。因此，需要对特定微环境中的巨噬细胞进行时间历程、多重标记、高空间分辨率的体内观察[16]，有望深刻理解巨噬细胞的分类、功能及行为。

2 巨噬细胞在伤口愈合和疤痕形成中的作用

如前所述，巨噬细胞通过表型分化在伤口愈合过程中发挥了重要作用，下面就巨噬细胞与急性伤口、慢性伤口及疤痕形成的关系三方面进行阐述。

2.1巨噬细胞与急性伤口的关系 巨噬细胞几乎参与了伤口愈合的所有阶段。组织发生损伤后，血小板首先在受伤部位募集，防止受损血管进一步失血。接着，中性粒细胞到达伤口，杀死微生物，并清除细胞碎片[17]。在早期阶段，浸润在伤口局部的巨噬细胞被活化成为M1表型，对所有微生物、基质和血小板的细胞碎片进行吞噬，并分泌促炎介质和趋化因子以招募更多的循环单核细胞[18]。Rasmussen等[19]研究发现，在转基因斑马鱼中，表达绿色荧光蛋白(GFP)的脊椎动物表皮细胞对损伤后产生的神经元碎片进行吞噬，提示脊椎动物表皮细胞可能是一种具有广谱-特异性吞噬功能的巨噬细胞。在伤口修复的后期阶段，巨噬细胞产生各种细胞因子(如TNF-α)来诱导中性粒细胞凋亡，随后从M1促炎表型转换为M2抗炎表型并吞噬凋亡中性粒细胞，以缓解伤口的局部炎症[16]。Paredes等[20]证明红色荧光染料(mCherry)标记的巨噬细胞在双转基因幼虫伤口处吞噬了GFP标记的坏死/凋亡粒细胞。

2.2巨噬细胞与慢性伤口的关系 慢性伤口是指3个月或更长时间内未被治愈的皮肤屏障缺损，它不经历典型伤口修复的四个阶段，而是陷入炎症阶段，并进入炎症和组织破坏的恶性循环[21]。典型的伤口修复的四个阶段包括：①血小板介导的止血；②炎症；③角蛋白细胞增殖和迁移到伤口再上皮化、成纤维细胞迁移、收缩和胶原降解导致瘢痕形成；④伤口血管的清除和瘢痕组织的重塑。慢性伤口往往具有一些共同的特征，包括氧化应激、蛋白酶失衡、生物膜形成或伤口感染、水肿以及延长持续的白细胞募集[22,23]。

与急性伤口不同，慢性伤口中巨噬细胞M1型到M2型巨噬细胞的转化是失调的[24-26]。在慢性伤口边缘，大约80%的细胞是M1型巨噬细胞，导致了慢性伤口的持续炎症最终导致难以愈合或疤痕的形成[24]。Kim等[27]用生物发光成像(BLI)证明，M1促炎巨噬细胞向伤口的运输增加导致持续性炎症和伤口愈合受损。糖尿病小鼠的伤口处M2型巨噬细胞水平偏低，导致调节修复增殖阶段的生长因子水平降低，如TGF-β1、IGF-1和VEGF，同时具有高水平的促炎性细胞因子和介体，如TNF-α、IL-1β、IL-17和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，不利于伤口的愈合[24,26,28-30]。研究表明，慢性创伤患者的伤口液中存在高水平的促炎细胞因子[24,31]。高水平的促炎介质(如TNF-α)会导致皮肤成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶(MMP-1、MMP-3)和基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)的精细平衡被打破，造成伤口环境中细胞外基质蛋白过度水解，形成慢性伤口[32]。对慢性伤口的理解远远落后于急性伤口的部分原因可能是缺乏一种能充分概括人类病理的动物模型。

2.3巨噬细胞调节疤痕形成的机制 疤痕形成是伤口异常愈合的最终结果，受伤口愈合中纤维化、疤痕胶原沉积、血管生成等因素综合影响，并伴随疼痛、硬化或纤维化等症状，大面积的疤痕甚至会导致一些细胞或部位的功能丧失，从而影响正常生理活动。巨噬细胞在疤痕的形成过程中发挥重要作用。新生的PU.1基因敲除小鼠是一种完全缺乏巨噬细胞的动物模型，研究发现这种模型小鼠与对照小鼠以相同的速度修复皮肤，但疤痕形成却大大减少，这表明巨噬细胞调节疤痕形成[33]。利用白喉毒素驱动的溶菌酶M特异性消融术或CD11b特异性细胞系消融术选择性地清除所有巨噬细胞表型的结果也表明，巨噬细胞对伤口愈合是必要的，并且调节疤痕形成[34-36]。事实上，最早研究巨噬细胞在修复中的作用时，使用抗巨噬细胞血清耗尽这些细胞就显示出了创伤修复的受损[37]。最近的研究证实并扩展了这些发现，表明在整个修复过程中特定的巨噬细胞消除会导致再上皮化和伤口收缩延迟，胶原沉积减少，血管生成受损，以及愈合伤口中的细胞增殖减少[35]，有助于减少瘢痕形成。

疤痕形成是伤口愈合不良的结果，目前的疤痕治疗方法还是以传统治疗方法为主，如敷料、局部治疗、外科修复、注射处理、压力疗法、激光等，治疗人类疤痕和其他纤维化疾病的有效新型药物还有待开发研究[38]。子宫内膜严重损伤会导致宫腔黏连，正常结构性细胞的增殖分化异常，大量的纤维组织替代，而目前宫腔黏连的主要治疗方法是手术分离，但该方法无法解决内膜瘢痕化。迄今的发现已表明，伤口巨噬细胞在伤口修复中起着难以替代的特殊作用，未来研究若着眼于调整异常修复条件中的巨噬细胞，可能会得到更为有效的缓解或治疗伤口愈合不良及疤痕形成的新方法。

2.4巨噬细胞参与不同组织的伤口愈合 巨噬细胞存在于所有组织中，不同组织中巨噬细胞促进伤口愈合的过程具有组织特异性，但也具有共性[39]。通过充分了解巨噬细胞差异与共性可以确保适当的修复，或通过调整系统免疫功能辅助损伤部位的巨噬细胞进行修复，可能是治疗不良修复导致疾病的重要机遇。

大量研究表明M(IL-4)巨噬细胞在组织修复中发挥重要作用。有研究证明小鼠直到出生后7 d可以再生心脏组织，主要依赖于单核细胞和巨噬细胞[40]。M(IL-4)被认为是主要的组织修复巨噬细胞，表达多种伤口愈合因子，如精氨酸酶、细胞外基质成分和生长因子[如VEGF-A、血小板衍生生长因子(PDGF)和胰岛素样生长因子(IGF)][3,8,41]。在缺乏M(IL-4)的小鼠中，皮肤伤口愈合延迟，血管稳定性受损[42]。对皮肤和肺组织修复过程的研究表明，M(IL-4)的作用可能在组织形成阶段最为突出，有助于细胞增殖、成纤维细胞的调节、胶原蛋白的产生和交叉连接，并具有广泛的抗炎功能。相对于皮肤内伤口修复的不同阶段，肺部巨噬细胞参与的组织形成阶段是提前的，这种伤口修复的快速开始可能是肺泡巨噬细胞本身已经倾向于伤口修复相关亚型的结果。有研究认为肺部通过提供促炎性细胞因子，增加肺泡巨噬细胞的激活阈值，从而在肺中留下特有的耐受反应，显著促进肺泡巨噬细胞的表型转换。皮肤组织中的伤口修复主要集中在皮肤完整性的恢复上，但是原有皮肤结构的许多方面及其高度分化的区域化并没有被重建。相比之下，即使在严重损伤或手术切除部分肺叶后，肺组织仍具有显著的再生能力，可导致肺泡结构的恢复[43,44]。由此可见，不同组织具有独特再生能力，而巨噬细胞在其中的特征性作用不可忽视。

Godwin等[45]发现巨噬细胞被系统性去除后，蝾螈无法再生肢体，而是形成瘢痕组织。对免疫信号进行综合性分析，发现巨噬细胞浸润是蝾螈肢体再生所必需的。具体地说，蝾螈保留了许多哺乳动物细胞因子/趋化因子的信号特征，在截肢后最初的24 h以内，蝾螈的免疫系统同时启动了炎症和抗炎症应答。在这一阶段系统性去除巨噬细胞，会导致伤口闭合，肢体再生失败，这一现象伴随有广泛的纤维化。之后恢复蝾螈体内的巨噬细胞，并再次进行截肢，发现蝾螈的再生能力得到完全恢复。

肌成纤维蛋白转化是伤口愈合过程中疤痕形成的主要原因，也是慢性或急性损伤(如肝纤维化、肾纤维化和肺纤维化)时器官组织纤维化的主要原因[46]。细胞谱系追踪研究表明，巨噬细胞可以在人体和实验性纤维化过程中不同程度地转化为肌成纤维细胞[14,47-48]。虽然巨噬细胞-肌成纤维细胞转化(macrophage-to-myofibroblast transition，MMT)的机制仍在研究中，但已明确标志着MMT的关键步骤是巨噬细胞产生胶原。活体内二次谐波和双光子激发荧光(SHG/TPEF)显微术可以监测这一关键过程，并可能为将来体内MMT提供更多的可视化证据。MMP12是一种具有弹性蛋白酶活性的金属弹性蛋白酶，在各种损伤模型下可调节伤口愈合过程中的纤维化[49]。Chan等[50]通过活体成像证明，在伤口修复过程中MMP12对角膜疤痕的产生有抑制作用。结果显示MMP12小鼠角膜损伤中EGFP标记的髓系细胞(巨噬细胞)的浸润增多，释放的MMP12增多，从而减弱角膜肌成纤维蛋白转化和血管生成反应，以避免在伤口修复过程中出现纤维化。通过提高MMP表达，巨噬细胞亚群在修复肝和肺的炎症和纤维化中的作用有明显提高[51]，其中Ly6ChiF4/80IntCD11bhi巨噬细胞被鉴定为负责重塑肝疤痕的恢复性巨噬细胞[52]。另外，血吸虫病中的一种寄生虫感染能够引起慢性损伤和炎症，并导致不可逆的纤维化，M2型巨噬细胞能够控制该病产生炎症和疤痕，从而减缓致死纤维化的发展。这些M2巨噬细胞来源于LysMloF4/80hiCD11bhiIL-4Ra+巨噬细胞[42]。这些研究提示，疤痕修复研究也许可以从多个器官修复之间的共性入手，找到更为有效的治疗方法。

局部炎症消退是恢复组织稳态的关键步骤。伤口巨噬细胞可能通过局部凋亡、迁移到淋巴结和脾脏等多种途径被清除[53]。前面的证据表明巨噬细胞是伤口愈合的关键调控因素[49,55]，进一步对其研究可能为避免伤口愈合中疤痕的形成提供治疗方法。

3 巨噬细胞与子宫损伤修复的关系

前文具体介绍了巨噬细胞在伤口愈合和疤痕形成中的重要作用，其中包括巨噬细胞参与不同组织伤口修复的机制，而巨噬细胞参与子宫损伤修复的研究尚浅，因此可以通过研究巨噬细胞参与其他组织伤口愈合的机制进而为研究子宫内膜修复中巨噬细胞的作用提供有力参考，结合子宫内膜巨噬细胞的特性，有可能提出以巨噬细胞为靶点的子宫内膜重建的新策略。

蜕膜组织是子宫内膜间质的一种特殊组织，它对于妊娠的建立和维持至关重要。目前认为，蜕膜巨噬细胞是人类妊娠期子宫内抗原呈递细胞的主要亚群，位于滋养层侵入和妊娠早期螺旋动脉重塑期间的螺旋动脉附近，在血管重构中起着重要作用。对于人类来说，巨噬细胞占妊娠期蜕膜白细胞的20%～30%，其数量随孕龄而变化[56]。在受精卵着床期间，蜕膜巨噬细胞大多为M1表型。随后滋养层附着在子宫内膜内层并侵入子宫基质时，它们开始转变成M1/M2型混合的状态[57]。这种混合极化模式通过子宫血管重塑过程来维持，从而在妊娠早期和妊娠中期建立足够的胎盘-胎儿血液供应[58]。胎盘发育完成后，蜕膜巨噬细胞表型发生转变，以M2表型为主，以防止胎儿被母体排斥，并允许胎儿生长直至分娩。正常妊娠期的蜕膜巨噬细胞主要为M2型极化，通过产生基质金属蛋白酶、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子和IL-10等多种因子，在血管生成、螺旋动脉重塑、绒毛外滋养层侵入和免疫调节等方面发挥重要作用。而在病理妊娠期间，蜕膜M1巨噬细胞数量增加，分泌破坏性的促炎因子，如TNF-α、一氧化氮和IFN-γ[59]，影响血管生成、组织内稳态、滋养层侵袭、螺旋动脉重塑以及胎盘发育，导致一系列妊娠疾病，包括先兆子痫、胎儿生长受限和死胎。

总之，巨噬细胞作为妊娠早期第二大蜕膜白细胞群，通过清除凋亡细胞碎片、细胞外基质分子和细胞因子的分泌、抗原呈递功能，在组织重塑中起着重要作用，有助于母胎免疫耐受的建立[60]。异常活化的蜕膜巨噬细胞可能导致一系列妊娠疾病。研究蜕膜巨噬细胞对建立正常和异常的胎盘-胎儿界面的作用，可以更好地了解妊娠疾病的发病机制，寻找这些疾病的新治疗靶点。另外，研究子宫内膜中巨噬细胞与T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)等其他免疫细胞互相作用的机制，可以为子宫损伤修复提出新的解决方案。

4 巨噬细胞的调控与组织再生的策略

巨噬细胞除了具有吞噬细胞碎片、外来病原体和凋亡细胞的作用，还积极参与伤口愈合与组织再生过程(主要是M2型巨噬细胞)[3]。通过生物材料和药物输送系统调节免疫系统中巨噬细胞表型，使其向M2型极化，也许能够成为一种促进组织再生的治疗策略(图1)。

研究生物材料理化性质对巨噬细胞的调控方式具有重要价值。生物材料交联是其中的一种重要的方式，高交联水平的支架通常会对巨噬细胞表型转换产生影响[61，62]。已经证明，植入大鼠体内的碳化二亚胺交联形式的小肠黏膜下层会优先诱导促炎巨噬细胞，而未处理的黏膜下层则主要诱导抗炎巨噬细胞。巨噬细胞黏附和细胞因子分泌还受到表面化学的影响。例如，与疏水表面相比，尽管亲水/中性表面上的巨噬细胞较少，但巨噬细胞被进一步激活，产生的细胞因子(IL-1、IL-6、IL-8和IL-10)明显增多。有关巨噬细胞极化作用的形态学研究表明，刺激巨噬细胞伸长有利于促进抗炎极化[63]，这可以通过微模式化表面和控制附着来实现，也可以通过表面上的巨噬细胞配体促进细胞的伸长来实现[61]。

图1 基于生物材料和药物输送系统设计促进组织再生的治疗策略Fig.1 Therapeutic strategies for tissue regeneration based on biomaterials and drug delivery systems

危险信号和促炎细胞因子引起的炎症是启动组织愈合的必要条件[64]。基质细胞延伸因子-1(SDF-1)是一种炎性和促血管生成的趋化因子，已被证明在组织愈合过程中非常重要，特别是其调动祖细胞的能力[65]。大量的研究已经使用生物材料，如丝胶原、明胶、海藻酸盐、聚乙二醇化纤维蛋白等，作为载药系统结合SDF-1来治疗组织损伤，这种策略的有效性已在肌腱、心肌、皮肤和肝脏模型中得到证实[65-68]。这种生物材料可以用于招募CXCR4+细胞，包括巨噬细胞、造血干细胞和MSCs并增加血管生成[65，69]。然而，SDF-1治疗策略的限制因素之一是它对蛋白酶的敏感性，容易被MMP-2和丝氨酸外肽酶CD26降解。可以通过修改SDF-1上面的MMP-2/CD26裂解位点或用共传递酶抑制剂来克服[65]。限制因素之二是较高剂量的SDF-1会促进巨噬细胞驱动的增生性瘢痕形成[61]。因此，在设计治疗方案时，SDF-1剂量的选择非常重要，以避免纤维化的发生。

虽然组织损伤部位的炎症是启动愈合反应所必需的，但消退炎症对于促进愈合过程和恢复组织完整性至关重要。巨噬细胞的促炎功能在炎症的早期阶段是必不可少的，但是适当的组织愈合需要巨噬细胞及时转化为抗炎表型。巨噬细胞的促进炎症消退的活性主要体现在Tregs的形成和维持。Tregs能创造一个有利于组织修复的抗炎环境，并有助于维持巨噬细胞的抗炎表型[70]。促进巨噬细胞从促炎状态到炎症消退状态转变的治疗策略可以改善愈合过程。例如，一种基于消退素(resolvins)的策略已经被证明能够通过增强腹膜炎的消退来促进肥胖糖尿病小鼠的伤口愈合[71]。同样，在糖尿病小鼠的伤口上给予保护素(protectins)也改善了再上皮化和肉芽组织的形成以及神经支配[72]。注射消退素和脂氧素(lipoxins)也被证明能够控制壳聚糖支架植入后诱导的巨噬细胞极化[73]。Maresins由内源性二十二碳六烯酸通过活化的巨噬细胞转化而成，是一个有效的抗炎家族，能够促进炎症消退[74]。M(IFN-γ)巨噬细胞通过释放TNF-α等细胞因子引起炎症，在某些情况下被证明能积极调节组织修复和再生，但过量会损害愈合过程。常用止痛药，例如阿司匹林、布洛芬和己酮可可碱，可抑制巨噬细胞释放TNF-α，起到抗炎作用[75-77]。使用透明质酸作为TNF-α单克隆抗体的运载工具，对诱导烧伤后大鼠的早期愈合是有效的[78]。抗炎细胞因子(如IL-10)参与促炎巨噬细胞到抗炎巨噬细胞的转换，对于组织修复和再生是至关重要的[3]。小鼠模型证明IL-10参与无疤痕愈合，胎儿小鼠能够通过IL-10依赖机制修复皮肤损伤并不产生疤痕，这种能力可以在过表达IL-10的成年小鼠身上也有所体现[79]。有研究表明，利用以肝素为基础的凝聚层作为IL-10的传递载体，能够显著降低小鼠心肌梗死后的纤维化程度[80]。

共传递生长因子和免疫调节剂也可以应用于组织修复。例如，富含血小板的血浆(PRP)中含有高水平的生长因子，可以在L-乳酸接枝明胶中与含有鞘氨醇-1-磷酸激动剂(SEW2871)的巨噬细胞吸引胶束一起输送，以增加小鼠的骨再生[81]。有趣的是SEW2871胶束和PRP在使用3 d后提高了TNF-α的水平，并在第10天增加了抗炎细胞因子IL-10。使用相同的系统，SDF-1与SEW2871胶束共输能够使小鼠皮肤伤口闭合率增加一倍以上。其可能的原因是SDF-1/SEW2871组合能够将MSC和巨噬细胞招募到受损皮肤中[82]。

不同的免疫细胞和免疫调节剂参与组织愈合过程的各个阶段，通过调控免疫系统，特别是关键免疫细胞亚群，是促进组织再生的一个合理策略。但是免疫系统调节各种器官和组织修复的机制仍需深入研究。巨噬细胞在组织愈合过程的大多数阶段都是至关重要的，但其改变表型促进组织再生和纤维化的机制尚不完全清楚，需要进一步的研究。

5 结论与展望

巨噬细胞在伤口修复过程中发挥着至关重要的作用。促炎M1表型更常见于修复的早期阶段，到伤口愈合的后期是促修复的抗炎M2表型。两者之间有一个过渡态时期，巨噬细胞表达混合M1/M2表型。失控的炎症和巨噬细胞表型的异常是阻碍伤口闭合的主要原因。巨噬细胞参与了组织愈合过程的大多数阶段，我们可以利用生物材料和药物传递系统传递各种免疫调节剂，以刺激巨噬细胞向促修复亚型极化或招募伤口愈合前的巨噬细胞亚群，从而发展再生策略。更好地了解巨噬细胞在病理进程中的功能和作用将为伤口愈合和组织修复的诊断、预后评估和治疗干预提供新的启示，并为子宫损伤修复开拓新思路。