活细胞标记和流式细胞术应用于体外检测巨噬细胞吞噬活性的方法建立①

王佳佳 王 磊 宋兴辉 李艳伟 郭 春 黄莹莹 刘 丽

(浙江大学医学院公共技术平台,杭州 310058)

巨噬细胞发挥吞噬功能对实现机体的天然免疫防御和维持内环境稳定是至关重要的[1-3]。人们在研究巨噬细胞的吞噬活性即其对颗粒物的摄取时，以往常用方法有显微镜观察和计数或流式细胞术检测被吞噬颗粒标记的荧光素信号确定单个样本的吞噬率[4-6]。

然而多项研究表明，巨噬细胞对待吞噬颗粒的吞噬功能与两者作用比例相关[7，8]，即在巨噬细胞发生吞噬作用时，巨噬细胞和待吞噬颗粒物比例直接影响吞噬率的结果，对于经过体外特定处理的巨噬细胞，如经IFN-γ刺激或者RNA干扰特定基因等，常会出现细胞量与对照组的不一致。在此情况下，比较特定处理对吞噬功能的影响时，经处理的巨噬细胞和对照巨噬细胞需进行细胞计数，调整巨噬细胞和待吞噬颗粒物比例一致，方可后续试验。该步骤必不可少，却存在细胞计数不准确和严重耗时的问题，直接影响巨噬细胞的活性和吞噬率结果的准确性。

因此，对体外巨噬细胞吞噬活性的研究来说，保证样本和对照细胞在一样的环境体系下完成吞噬过程，结果既准确又可靠就显得非常必要。本研究旨在通过活细胞标记和流式细胞术的联合应用，建立一种简便可靠的方法研究体外巨噬细胞的吞噬活性。

1 材料与方法

1.1材料 小鼠巨噬细胞RAW264.7来自实验室保种细胞； Cell TraceTMCFSE Cell Proliferation Kit(no.C34570)购自Invitrogen公司；DMEM培养基为Hyclone产品；胎牛血清和胰酶Trypsin-EDTA购自Gibco公司；Alexa Fluor 594标记的大肠杆菌(E.coli)k-12购自Molecular Probes公司；脂多糖LPS(L2880)购自Sigma公司。

流式细胞分析仪型号为美国Becton Dickinson公司的Fortessa和ACEA公司的Novocyte；非接触超声破碎仪Bioruptor为 Diagenode 公司产品；荧光倒置显微镜为德国蔡司的Axio Observer A1。

1.2方法

1.2.1RAW264.7 细胞培养 RAW264.7细胞培养于含10% 胎牛血清的高糖DMEM培养基中，然后放置于37℃、5%CO2的培养箱培养。

1.2.2荧光标记的大肠杆菌超声预处理 将Alexa594荧光标记的大肠杆菌颗粒溶解在1 ml的PBS中，充分振荡均匀。非接触超声破碎仪在4℃处理20 s、40 s、60 s(60 kHz和300 W功率)，荧光显微镜下观察荧光标记的大肠杆菌颗粒处理情况。

1.2.3RAW264.7细胞CFSE染色 取对数生长期状态良好的RAW264.7细胞约5×106个重悬在0.5 ml 无菌PBS中；CFSE贮存液(5 mmol/L)0.4 μl 溶解于0.5 ml的PBS溶液；细胞悬液与CFSE染液充分混匀，室温孵育10 min(CFSE染液工作终浓度 2 μmol/L)；1 ml的细胞染液加9 ml含10%FBS的细胞培养基终止反应，室温放置10 min；离心去除上清，细胞沉淀用含10%FBS的培养基重悬，置于培养箱培养。

1.2.4吞噬试验 6孔板每孔铺约5×105个细胞，以一定比例加入Alexa594标记的大肠杆菌，在细胞正常培养条件下置于CO2培养箱一定时间。吸掉培养基，预冷的PBS洗涤2次，台盼蓝处理3 min淬灭细胞表面黏附的荧光颗粒，预冷PBS洗涤2次，胰酶消化贴壁细胞，细胞培养基吹打重悬，离心将细胞沉淀重悬在0.5 ml的PBS缓冲液中，50 μm孔径的细胞筛过滤，流式细胞仪上机检测。

1.2.5不同细胞与大肠杆菌比例、吞噬作用时间条件的摸索 取对数生长期状态良好的RAW264.7细胞，调整每样本以5×105个细胞接种于6孔板单个孔中。细胞设置9组，分别以细胞与大肠杆菌比例为1∶1、1∶5、1∶10 ，每种细胞与大肠杆菌比例对应3个孵育时间15 min、30 min、60 min，如1.2.4完成吞噬试验。

取对数生长期细胞，调整每样本以5×105个细胞接种于6孔板单个孔中。细胞设置3组，分别以细胞与大肠杆菌比例为1∶25、1∶50、1∶100 ，孵育时间30 min，如1.2.4完成吞噬试验。

1.2.6应用活细胞标记在同一体系中完成LPS处理和未处理细胞的吞噬活性检测 取RAW264.7巨噬细胞用0.01 μg/ml的LPS处理16 h，经处理的细胞和标记CFSE的对照细胞混匀，在一个体系中和荧光标记的大肠杆菌孵育，吞噬条件是细胞与大肠杆菌比例为1∶10，孵育时间是30 min，如1.2.4完成吞噬试验。

1.2.7CFSE对巨噬细胞吞噬功能的影响 设计3组吞噬试验，第1组不做任何处理的CFSE标记的RAW264.7巨噬细胞和CFSE未标记巨噬细胞混匀加入大肠杆菌完成吞噬；第2组是LPS处理的CFSE未染色细胞和不做处理的CFSE染色细胞混匀吞噬；第3组是LPS处理的CFSE染色细胞和不做处理的CFSE未染色细胞混匀吞噬。吞噬条件是细胞与大肠杆菌比例为1∶10，孵育时间是30 min，如1.2.4完成吞噬试验。

1.3统计学处理 应用GraphPad Prism7.0软件分析，采用配对t检验比较组间差异，P<0.05为差异有统计学意义。流式数据使用FlowJo V10软件分析。

2 结果

2.1荧光标记的大肠杆菌超声预处理条件 荧光标记的大肠杆菌颗粒溶液在不同条件下超声处理，荧光显微镜下观察，确定可获得单个大肠杆菌颗粒的超声条件。实验结果(图1)表明，大肠杆菌颗粒溶液在未超声处理时存在大量的团块聚集体，超声20 s颗粒团块聚集体的情况明显改善，超声40 s大肠杆菌颗粒基本分散为单个细胞，超声处理60 s大肠杆菌颗粒更好地分散为单个细胞，且由于没有团块存在，可看到有效的单颗粒的量明显增加。长时间的超声会破碎大肠杆菌，尽可能使用能将颗粒分散均匀的最短超声条件为佳。因此，将荧光标记的大肠杆菌颗粒进行60 s超声处理可获得均一性好、分散的单个大肠杆菌颗粒溶液，更好地用作后续的吞噬试验。对均匀分散的大肠杆菌颗粒用软件计数，计算大肠杆菌溶液密度约为2.5×106个/μl。

2.2RAW264.7细胞的CFSE染色 活细胞示踪染料CFSE标记RAW264.7细胞，培养24 h后，荧光显微镜下观察细胞情况(图2)，细胞生长状态良好，荧光染色均匀，可用于后续试验。

2.3细胞与大肠杆菌比例、孵育作用时间的条件确定 实验结果(图3B)显示，细胞吞噬率随着大肠杆菌与细胞的比例增加而升高，随孵育时间增长(15 min 到60 min)而升高。但是细胞从15 min到30 min，细胞吞噬率上升速度较快，从30 min到60 min，细胞吞噬率上升速度在减缓，为了检测细胞的吞噬活性功能，将确定30 min为细胞吞噬活性的较佳孵育时间。 在确定孵育时间后， 进一步优化细胞与待吞噬物大肠杆菌比例。提高细胞与大肠杆菌的比例为1∶25、1∶50、1∶100，检测吞噬率分别为82.2%、92.8%、98.1%，结果为较高的细胞吞噬率，若以这些比例完成吞噬检测，仅靠吞噬率将难以比较出实验结果差异。综合实验结果(图3A、C)，确定1∶5到1∶10为较佳的细胞与大肠杆菌比例。

图1 荧光标记的大肠杆菌超声处理后荧光显微镜下观察(×400)Fig.1 Observation of sonication-treated E.coli by fluore-scent microscope labeled with Alexa594(×400)Note: E.coli untreated with sonication (A) and E.coli sonicated with different time of 20 s (B),40 s(C) and 60 s(D).

图2 荧光显微镜下观察CFSE染色的RAW264.7细胞(×200)Fig.2 Observation of RAW264.7 labeled with CFSE by fluorescent microscope(×200)Note:A.White light;B.Fluoresent.

图3 巨噬细胞在不同吞噬条件下的吞噬率Fig.3 Percentage of phagocytic cells under different phagocytic conditionsNote: A，B.The percentage of phagocytic cells under different incubation time or ratios of cells to E.coli as shown by column diagram and line chart；C.The percentage of phagocytic cells treated with different ratios of cells to E.coli represented by Column diagram.

图4 流式细胞术分析LPS对巨噬细胞吞噬活性的影响Fig.4 Influences of LPS on phagocytotic activities of macrophage analyzed by flow cytometryNote: A.Only live cells were gated in the “cell” on dot-plot of FSC-A and SSC-A;B.Single cells were then gated in “single cells” on dot-plot of FSC-A and FSC-H from region “cell”;C.Population from the region “single cells” was distinguished into CFSE+ and CFSE-subpopulations based on CFSE fluorescence intensity;D,E.Cells from region “CFSE+” and “CFSE-” are further analyzed for the percentages of phagocytic cells which were indicated by the number in the outlined areas.

图5 CFSE标记对细胞吞噬活性的影响Fig.5 Influences of CFSE on phagocytic activities of macrophage analyzed by flow cytometryNote: A.The gating strategy of flow cytometry is the same as Figure 4.Cells from region “CFSE+” and “CFSE-” are further analyzed for the percentages of phagocytic cells.Three groups of experiments are shown in (1),(2) and (3).Data are representative of the experiment in each group；B.The percentages of phagocytic cells corresponding to figure A (2) and (3) were represented by Column diagram.Error bars show in each group.

2.4应用活细胞标记在同一体系中完成LPS处理和未处理细胞的吞噬活性检测 活细胞示踪染料CFSE标记对照组巨噬细胞，对未标记CFSE的巨噬细胞使用免疫刺激剂LPS处理，标记CFSE的细胞不做任何处理即对照组巨噬细胞。将LPS处理的巨噬细胞和对照组巨噬细胞混合，在一个体系中和Alexa594标记的大肠杆菌孵育完成吞噬过程，流式细胞仪上机检测吞噬结果。流式设门分析如图4，在FSC-A和SSC-A散点图中设椭圆形门圈定主细胞群，排除细胞碎片和状态不好的细胞(图4A)，然后在FSC-A和FSC-H散点图中设门圈定单细胞群，排除细胞聚集体(图4B)，然后在Alexa594-A和CFSE-A双荧光散点图中分别设门圈出CFSE阳性细胞和CFSE阴性细胞(图4C)，对CFSE阳性细胞用Alexa594-A作单参数直方图分析其Alexa594阳性率即对照组细胞吞噬率为48.6%(图4D)，对CFSE阴性细胞分析也就是LPS处理的靶巨噬细胞吞噬率为62.3%(图4D)。结果表明，LPS处理后细胞吞噬活性显著增加，与文献报道一致。实验也表明，通过活细胞标记区分，在同一体系中完成LPS处理和未处理细胞的吞噬活性检测是非常可行的；并且，对照组和处理组细胞处在同一个吞噬环境中，吞噬率反映的吞噬活性更为准确。

2.5CFSE对巨噬细胞的吞噬活性影响 研究设计3组吞噬试验，第1组是不做任何处理的CFSE标记细胞和CFSE未标记细胞混匀加入大肠杆菌完成吞噬，也就是混合的两种细胞是一样的细胞，只是一群细胞进行了活细胞染色，结果显示[图5A(1)]二者的吞噬率是非常接近的，这说明活细胞染料CFSE(染液工作终浓度2 μmol/L)对细胞的吞噬功能活性没有影响。第2组是LPS处理的CFSE未染色细胞和不做处理的CFSE染色细胞混匀吞噬，第3组是LPS处理的CFSE染色细胞和不做处理的CFSE未染色细胞混匀吞噬，两组实验结果见图5A(2)、5A(3)、4B，显示LPS处理的细胞均表现出高于未处理细胞的吞噬率，且结果均有显著性差异(P<0.05)，这也说明CFSE染色对细胞吞噬活性没有影响，实验中选取CFSE标记的细胞或者CFSE未标记的细胞做处理组都可以，结果是一致的。

3 讨论

巨噬细胞是人们研究细胞吞噬功能的主要对象，以其对颗粒物的摄取即吞噬率或吞噬指数来反映巨噬细胞的吞噬功能。

普通来讲，测定吞噬率的方法是对吞噬颗粒物进行普通染色或者荧光标记，吞噬细胞与待吞颗粒物孵育后，在显微镜或荧光显微镜下观察和计数来计算吞噬细胞对颗粒物的吞噬情况[4]，这种方法操作较为繁琐且准确性差。流式细胞术利用流式细胞仪可实现对液流状态下的单列细胞进行逐个、快速、多参数的定性和定量分析，可获得细胞大小、颗粒度和荧光信号等参数信息。自1982年由Steinkamp等[5]开创利用流式细胞术检测细胞对荧光微球的吞噬功能以来，越来越多的研究者利用流式细胞术检测巨噬细胞吞噬带有荧光信号的颗粒物，如检测吞噬细胞吞噬荧光微球、检测吞噬细胞吞噬荧光标记的细菌[6,7]。

然而吞噬率与细胞数和被吞噬颗粒比例有极大关系[7，8]，用流式检测巨噬细胞吞噬活性的缺点是，待比较吞噬活性的样本需要通过细胞计数，调整细胞数和被吞噬颗粒比例一致，结果才可靠。该步骤必不可少，却存在细胞计数不准确和严重耗时的问题，直接影响巨噬细胞的活性和吞噬率结果的准确性。

本研究在以下方面做了探索。首先优化了巨噬细胞吞噬功能检测的条件。一是待吞噬物大肠杆菌的超声条件，非接触超声破碎仪以60 kHz和300 W功率4℃处理60 s，可获得均一性好、分散的单个大肠杆菌颗粒。巨噬细胞的吞噬对象常见的是细菌、包被微球等，这些在经荧光标记后不管是洗过的沉淀颗粒还是冻干的干粉，依靠振荡重悬难以达到理想的单个颗粒，而团块对后续吞噬实验结果影响很大，会造成有效的单颗粒数量下降、吞噬指数不准确。二是确定30 min为细胞吞噬活性检测的最佳孵育时间，1∶5到1∶10左右为较佳的细胞与待吞噬物比例，这两个条件对于检测巨噬细胞系体外吞噬活性更为合适。

研究通过活细胞标记和流式细胞术的联合应用来检测巨噬细胞吞噬活性。采用活细胞示踪染料CFSE标记对照组巨噬细胞，对未标记CFSE的巨噬细胞使用免疫刺激剂LPS处理，标记CFSE的细胞不做任何处理即对照组巨噬细胞。将LPS处理的巨噬细胞和对照组巨噬细胞混合，在一个体系中和Alexa594标记的大肠杆菌孵育完成吞噬过程，通过流式细胞术设门分析可同时获得LPS处理的巨噬细胞和对照组巨噬细胞的吞噬率，结果与文献报道一致。这表明通过活细胞标记区分，在同一体系中完成LPS处理和未处理细胞的吞噬活性检测是非常可行的；并且，对照组和处理组细胞处在同一个吞噬环境中，吞噬率反映的吞噬活性更为准确；研究选用的两种荧光信号CFSE和Alexa594属于不同激光器激发的荧光素，没有荧光溢漏，这不仅意味着流式检测时不需要补偿调节，更意味着细胞分群更清晰(图4C)，流式设门更准确；与以往的流式检测单荧光信号的吞噬功能相比，虽增加了活细胞标记，省却了吞噬试验之前对样本进行细胞计数和调整细胞量的步骤。

研究进一步探索了活细胞示踪染料CFSE是否会对巨噬细胞的吞噬功能造成影响。研究设计三组试验，实验证明了活细胞示踪染料CFSE对细胞的吞噬功能活性没有影响，在活细胞标记后选取CFSE标记或者CFSE未标记的细胞做处理组都可以，结果是一致的。

综上所述，本研究通过活细胞标记和流式细胞术的应用，建立了一种简便、可信度高的方法研究体外处理的巨噬细胞的吞噬活性。活细胞标记简化了以往对吞噬研究前期的处理步骤并能确保细胞吞噬条件一致，加之流式细胞术的快速检测，可以说该检测方法是简便、快速、准确的。该检测方法对于研究巨噬细胞的吞噬活性来讲，具有方法学方面的指导意义，同时对活细胞标记技术的推广有一定作用。