牛结核γ-干扰素ELISPOT方法在奶牛结核病检疫的应用
2020-04-11杨显超李凯航陶田谷晟赵洪进杨德全吴秀娟卢军王建
杨显超 李凯航 陶田谷晟 赵洪进 杨德全 吴秀娟 卢军 王建
(上海市动物疫病预防控制中心 201103)
众所周知,牛结核病是一种慢性人畜共患病,传染范围广和传染力强,该病严重损害整个畜牧业,威胁到人类健康[1]。该传染疾病非常重要的一个途径就是通过乳制品感染人。酶联免疫斑点试验 (ELISPOT) 是一种细胞免疫学检测方法,在单细胞水平上基于高通量检测机体分泌的抗体或细胞因子,从而得出我们所需,它其实就是ELISA 检测技术的外延[2]。因为ELISPOT 敏感性和特异性高,已被广泛用于各种传染病的检测。本研究旨在通过细胞免疫学手段,通过课题前期建立的牛结核γ-干扰素ELISPOT 检测平台,为日后基于此类方法进行牛结核病的检测和采取相应的防控措施,奠定科学的理论基础。
1 材料和方法
1.1 实验动物
上海某区5 个奶牛场共有1687 头奶牛,每年两次检疫使用颈部皮内变态反应 (SICT),出现阳性或可疑牛再对其及周围接触较为密切的牛只进行γ 干扰素ELISPOT 检测,目的在于更好的净化牛结核病。
1.2 主要试剂、设备
牛结核菌素购自某生物科技有限公司,试剂批号201008;牛γ-干扰素ELISPOT 检测试剂盒购自上海欣博盛生物科技有限公司,批号 3119-4HPW-2。酶标读数仪 Tecan Sunrise;酶联斑点图像自动分析仪 (CTL ImmunoSpot S6)。
1.3 牛结核变态反应试验
奶牛结核病按照国家标准 (GB/T18645-2002),用牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应试验进行奶牛结核病检测。判定标准为局部炎性反应明显,皮厚差≥4mm 判定为阳性牛;局部炎性反应不明显,2mm≤皮厚差<4mm 判定为可疑牛;无炎性反应,皮厚差<2mm 判定为阴性牛[3]。
1.4 ELISPOT 方法检测
1.4.1 牛外周血单核细胞的制备
奶牛尾静脉无菌抽取至少3ml 肝素抗凝血,吸取2ml 血与灭菌生理盐水 1:1 混合后,缓缓地加入含3ml 牛淋巴细胞分离液的离心管中,400g 离心20min。这时,外周血单核细胞聚集在云雾状层中,吸取单核细胞层加入灭菌PBS 混匀后,200g 离心10min,重复以上步骤两次。弃去上清,加入1640 培养基重悬,用细胞计数仪进行计数。
1.4.2 牛结核γ-干扰素ELISPOT 检测
按试剂盒说明书进行操作。大致步骤为在96 孔滤膜板中每孔加入 100μl 2.5μg/ml 的牛 γ 干扰素抗体 MT17.1,4℃包被过夜。在包被的板中,一份样品分 3 管加入 50μl 培养液、10μg/ml 的 禽 型 PPD、10μg/ml 的 牛 型 PPD。然 后 加 入50μl1.25×105细胞数的外周血单个核细胞悬液,置于 37℃、5%CO2培养箱培养 24h;取出弃培养上清,洗板 5 次,加入100μl牛 γ-干扰素检测抗体 MT307-biotin (0.25μg/ml),室温孵育2h;洗板 5 次,加入 100μl HRP,37℃孵育 1h;加入 100μl 底物,室温避光显色。加入纯净水终止反应,移除液体晾干;将96 孔板放入CTL ImmunoSpot S6 中,对实验结果进行扫描计数和分析[4]。
1.5 ELISPOT 同步检测牛结核病临床样品
用1.3 方法检测上海某区5 个奶牛场的1687 头奶牛,选取阳性、可疑牛及其周边密切接触的牛群228 头,采集其全血样品进行ELISPOT 检测,具体参照1.4 和1.5 步骤进行。
2 实验结果
2.1 变态反应检测结果
一共对5 个奶牛场1687 头奶牛进行颈部皮内变态反应(SICT),根据国家标准进行判定,共检出牛结核病阳性牛13头,阳性率为0.77%,阳性牛未表现出明显的临床症状;检出结核病可疑牛36 头,其余皆为阴性。
2.2 牛结核γ-干扰素ELISPOT 检测结果
颈部皮内变态反应 (SICT) 全检 1687 头奶牛后,将阳性牛、可疑牛及其密切接触牛228 头牛进行γ 干扰素ELISPOT 检测,出现15 例牛结核分枝杆菌阳性、213 例阴性。
2.3 两种方法符合率的比较
对上海存栏为1687 头奶牛进行颈部皮内变态反应(SICT),参见附表。共有 13 头阳性奶牛,36 头可疑牛检出,其余均为阴性,阳性牛未表现明显的临床症状。抽取228 头阳性牛、可疑牛及其密切接触牛228 头牛抗凝血进行牛结核γ-干扰素ELISPOT 检测,结果牛型结核病阳性15 份,阴性213 份。说明牛结核PPD 皮内变态反应结合γ 干扰素ELISPOT 可以有效提高牛结核病检疫的准确性,减少因单纯使用颈部皮内变态反应 (SICT) 出现的假阴性现象。在变态反应可疑牛中,仍然检出了2 份γ-干扰素ELISPOT 阳性牛,两者阳性符合率93%,阴性符合率99%。
附表 ELISPOT 方法与PPD 的比较 (单位:头)
3 讨论
酶联免疫斑点检测技术 (ELISPOT) 是近些年发展起来的新技术,是一种基于检测细胞因子的免疫学方法。该方法是将细胞培养与ELISA 技术结合起来新构建的一种检测技术,是在单细胞培养水平上体外检测特异性细胞因子。可以对细胞因子分泌量进行方便快速的定量检测,目前已经是国际上一项主流的免疫学检测技术。并且ELISPOT 检测技术也在动物研究领域具有广阔的应用前景[5]。
γ-干扰素ELISPOT 在结核病诊断上有很大意义,但在某些方面仍有一定的局限性。一是ELISPOT 检测技术能检测牛结核分枝杆菌,但其结果不能作为标准来直接判定是否为活动性结核病,且敏感性不是很高,因此在牛结核流行污染地区不能单独用此方法来排除结核病的类型[6]。二是环境中的结核分枝杆菌能明显影响ELISPOT 的结果,环境的暴露强度与该病的检测有正相关性[7]。因此,运用该检测方法作为单一判断标准可能会对结果造成误诊,故需要针对不同地区和不同牛群调整监测策略。三是此方法需要分离机体的外周血淋巴细胞,这对实验人员的操作水平提出要求。最后,由于ELISPOT 检测的费用高,使其较难进行大范围的推广和应用。免疫学检测技术的不断发展,ELISPOT 在动物疫病诊断的领域的应用也会更加深入,我们相信该技术会逐渐成为结核病实验室诊断的候选检测技术。