HPLC法测定乌发生发液中二苯乙烯苷含量

黄 丹，刘恒言，凌成利，向 韵，梁诗意，向爱香，雷 昌*

(1.湖南中医药大学/湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，湖南长沙 410208；2.湘西自治州民族中医院，湖南 吉首 416000)

脂溢性脱发(seobrrheic alopecia，SA)简称脂脱，又名男性型秃发、雄激素源性秃发，中医称之为“发蛀脱发”“蛀发癣”，临床多表现为头发油腻、多屑，有明显瘙痒感，额颞区及顶部的渐进性脱发，继而形成高额[1-2]。此病是皮肤科的常见病、多发病，也是难治性疾病之一。由于本病影响美观，常给患者带来很大的精神压力和心理负担[3]。

不同于医院的专业治疗，更多的SA患者倾向于生活中日常防护，洗发水作为和头发接触最多的日常用品，在解决毛发问题上有着一定便利性[4-5]。近年来，中药在洗发水中广泛应用，技术发展很快，起到了治疗SA的效果，受到广大消费者的热爱，该类型的中药洗发水也成为各机构研究的热点之一[6-7]。乌发生发液来源于老中医临床经验方，由制何首乌、侧柏叶、白鲜皮、路路通、墨旱莲等12味中药组成，方中用制何首乌、女贞子、墨旱莲滋阴补肾生发，侧柏叶生发乌发，当归、桃仁、红花活血化瘀，生地黄、熟地黄滋阴补血，白鲜皮清化湿热，路路通、刺蒺藜祛风除湿。全方共奏补肾生发、滋阴补血、活血化瘀、清热利湿、祛风除湿之功。该洗发液已于临床运用10余年，能有效治疗SA患者的脂溢性皮炎及瘙痒感，缓解SA患者的脱发症状，该产品已证明安全无不良反应。本研究以乌发生发液中君药何首乌的主要有效成分二苯乙烯苷为检测指标，采用高效液相色谱法测定其含量，为该制剂质量标准的建立提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Aigent-1260高效液相色谱仪(安捷伦仪器设备有限公司)，电子天平(AL204，梅特勒-托利多上海有限公司)，旋转蒸发仪(Heidolph Hei-VAP，上海本昂科技仪器有限公司)，水循环真空泵(SHB-Ⅲ，郑州紫拓仪器有限公司)，恒温循环鼓风干燥箱(WGL-230B，天津市泰斯特仪器有限公司)，KM-250DE超声波清洗器(昆山美超声仪器有限公司)，纯水仪(ELGA，UK)。

1.2 材料

二苯乙烯苷对照品(批号：J1708Z45941，中国食品药品检定研究院)；乙腈、甲醇为色谱纯，实验用水为纯化水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适应性

色谱柱采用依利特Supersil ODS-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈-水(25∶75)为流动相，流速为1.0 mL·min-1，柱温为30 ℃，检测波长为320 nm，进样量10 μL，理论板数按二苯乙烯苷峰计算应不低于2 000。

2.2 对照品溶液制备

精密称取二苯乙烯苷对照品4.1mg，置25mL量瓶中，加稀乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成每1mL中含二苯乙烯苷0.164mg的对照品溶液。

2.3 乌发生发液的制备

按照处方取何首乌、当归、侧柏叶、黑芝麻、黑豆等18味中药材，置于电热炉中，提取2次。第1次加10倍量水，浸泡30 min后，通电加热，自沸腾开始计时，提取2 h。第2次加10倍量水，通电加热，自沸腾开始计时，提取2 h，合并两次提取液(过200目筛)，冷却，50 ℃真空减压浓缩至200 mL，测定pH和密度，放入冰柜(-40 ℃)冷冻过夜，然后冷冻干燥，即得乌发生发液干燥粉末。

2.4 供试品溶液的制备

取乌发生发液干燥粉末0.5 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇25 mL，再称重，超声30 min，取出放冷，补重，摇匀，过0.45 μm微孔薄膜，注入棕色样品瓶中，即得。

2.5 阴性对照溶液的制备

按照配方，取除何首乌外的17种药材(当归、女贞子、黑芝麻等)，按照“2.3项下乌发生发液”方法，制成缺何首乌药材的乌发生发液，再按照“2.4项下供试品溶液制备”方法，制成缺何首乌的阴性对照溶液。

2.6 方法学考察

2.6.1 标准曲线的制备将二苯乙烯苷对照品溶液用稀乙醇分别稀释2、4、8、16、32、64倍，按照“2.1”项下色谱条件测定，设置进样量为10 μL，并以各自标准品的浓度为横坐标(X)，波长320nm下的峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。最终得二苯乙烯苷的线性回归方程为：Y=968.04X+15.793(r2=0.999 2)，线性范围为：3.29～16.4 μg。

2.6.2 稳定性试验取制备好的供试品溶液，于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h定时进样，每次进样10 μL，测定并计算得二苯乙烯苷峰面积的RSD为0.68%，表明供试品溶液稳定性良好。

2.6.3 精密度试验连续进样供试品溶液6次，每次10 μL，测定并计算得二苯乙烯苷峰面积RSD为0.90%。表明仪器精密度符合要求。

2.6.4 重复性试验取制备好的供试品溶液6份，依次进样，进样量10 μL，测得峰面积并计算得二苯乙烯苷含量RSD为0.59%，表明该法重复性良好。

2.6.5回收率试验精密量取6份已知含量的样品，分别加入一定量二苯乙烯苷对照品，照“2.1”项下色谱条件进样测定，结果见表1。计算得二苯乙烯苷的平均加样回收率为99.45%，RSD为1.56%，表明该法准确度良好。

表1 加样回收率试验结果

2.6 含量测定

取制备好的供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件，进样10 μL，测定二苯乙烯苷峰面积，代入标准曲线计算，得乌发生发液中二苯乙烯苷含量1.73 μg/mL。结果见图1。

3 讨论

3.1 流动相的选择

本试验比较了不同流动相系统的可行性，如乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸溶液等，结果表明采用乙腈-水溶液为流动相时，基线较平稳，目标峰无拖尾和前延，灵敏度高，分离度较好，故该实验中流动相采用乙腈-水溶液；再对此流动相不同比例(20∶80、25∶75、30∶70)进行考察，结果发现所用比例乙腈-水(25∶75)分离度最好，并且最大限度地节省了分析时间。

3.2 供试品制备方法选择

本试验比较了不同提取溶媒(70%甲醇、稀乙醇)，不同提取方法(超声、水浴回流)和提取时间(15 min、30 min、45 min)，从二苯乙烯苷含量、节约成本、便捷性等角度进行考察，确定了采用稀乙醇作为提取溶媒，超声提取30 min进行供试品溶液的制备。

图1二苯乙烯苷对照品(A)、乌发生发液样品(B)和阴性样品(C)的HPLC图谱

目前西医临床针对SA主要以外科手术、药物治疗为主，尽管疗效肯定，但大多数西药只能减少毛发脱落，且副作用较明显，某些药物虽能促进毛发再生，但停药后的继续脱发使得其疗效难以维持；缝缩术和植发术等外科手术方法，虽可改善秃发的不良视觉，达到一定的美容效果，但术后往往头发外观不自然，对于本身供区头发稀少的患者，手术难以实施；另外，秃发面积较大的患者需多次植发，手术费用高[8]。中医治疗SA方法多样，注重标本兼治，从整体上调节机体内分泌功能，在改善症状、延缓病程方面已取得较好的临床疗效，但其复杂的成分体系使得其药效物质基础研究困难。因此，本研究通过高效液相法测定乌发生发液中二苯乙烯苷的含量，不仅为本制剂的质量标准提供依据，同时对于该产品治疗SA的物质基础研究具有重要意义。