不同产地天麻标准汤剂的制备与质量评价研究

凌成利，雷 昌，刘洪兵，张济辉，向爱香，林宗善，朱 瑾，黄 丹

(湖南中医药大学 湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，湖南 长沙 410208)

中药标准汤剂即中药标准煎液，是以中医理论为指导，临床应用为基础，参考并结合现代提取方法，经过标准化工艺制备而成的单味中药的水煎剂[1]，可用于指导临床标准化用药，保证用药的准确性和安全性[2]。随着中药现代化步伐的加快，中药行业涌现出多种中药用药形式，如中药配方颗粒。中药标准汤剂是标准化以水为溶媒的包括配方颗粒在内的新型用药形式，较大程度上解决了中药配方颗粒等新型用药形式与临床中药汤剂间存在质量和疗效差异的问题[3-4]。在《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》(征求意见稿)中明确要求有关中药配方颗粒的所有项目均应与其标准汤剂进行对比研究[5]，故在中药配方颗粒研究前需进行其对应标准汤剂的研究。

天麻(GastrodiaelataBlume)为兰科植物天麻的干燥块茎，始载于《神农本草经》，列为上品，《开宝本草》亦有记载。天麻具有熄风止痉、平抑肝阳、祛风通络的功效，常用于头痛、肢体麻木等症状的治疗[6-7]。天麻为临床常用中药，目前关于其化学成分的研究颇多，其主要含有天麻素等酚类化合物、天麻多糖、对羟基苯甲醇等成分[8]。有文献[9]表明，鲜天麻的主要化学成分为天麻素与对羟基苯甲醇，且对羟基苯甲醇含量比天麻素高。目前研究天麻饮片指标成分含量测定及指纹图谱的文献较多，关于天麻标准汤剂的指标成分含量及指纹图谱的文献较少。

本文以天麻标准汤剂为例，阐述天麻标准汤剂的制备和质量评价方法。参照《中药配方颗粒管理办法》(征求意见稿)和《中药配方颗粒质量控制与标准制定要求》(征求意见稿)，收集数个不同产地的有代表性的天麻药材，通过制备标准汤剂并建立检测方法，测定天麻标准汤剂中天麻素及对羟基苯甲醇的含量并计算其出膏率和转移率。同时，对15批天麻标准汤剂进行HPLC指纹图谱的研究，为天麻配方颗粒的质量控制提供依据。

1 材料与试剂

电子天平(AL204，梅特勒-托利多上海有限公司)；水循环真空泵(SHB-Ⅲ，郑州紫拓仪器有限公司)；旋转蒸发仪(Heidolph Hei-VAP，上海本昂科学仪器有限公司)；Aigent-1260高效液相色谱仪(安捷伦仪器设备有限公司)；恒温循环鼓风干燥箱(WGL-230B，天津市泰斯特仪器有限公司)。

天麻素标准品(批号：110807-201809，纯度：98%)；对羟基苯甲醇标准品(批号：111970-201702，纯度：98%)购自中国食品药品检验研究院。水为超纯水，乙腈、甲醇为色谱级，其余为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

收集不同产地15批天麻药材，分别购自云南、东北、湖南、贵州、湖北等地，包括主要产区和道地产区，参照《中华人民共和国药典》(2015版)天麻各项指标检验要求，均合格。具体信息见表1。

表1 天麻药材信息

2 方法

2.1 供试品和标准汤剂制备

2.1.1 天麻标准汤剂制备 称取天麻药材20.0 g，置于500 mL圆底烧瓶中，加入9倍量水，充分润湿，浸泡30 min。待浸泡完全后，打开电热套，将圆底烧瓶置于电热套上，加热回流提取，保持沸腾30 min，180目筛网趁热过滤，残渣再加入7倍量水，回流20 min，180目筛网滤过，合并滤液，并减压浓缩至100 mL，即得天麻药材标准汤剂。

2.1.2 天麻供试品溶液制备 将上述天麻标准汤剂摇匀，取1 mL标准汤剂置于2 mL离心管中，3 000 rpm离心5 min，得上清液，即为供试品溶液。

2.1.3 天麻标准品溶液制备 称取天麻素和对羟基苯甲醇标准品适量，精密称定，加乙腈-水(3∶97)混合溶液，制成天麻素质量浓度为50 μg·mL-1，对羟基苯甲醇质量浓度为25 μg·mL-1的标准品溶液，摇匀，即得。

2.2 出膏率

分别量取“2.1”项下溶液适量，体积为V，搅拌均匀，置于75 mL圆底蒸发皿(重量为m1)中，恒温水浴加热蒸干，于105 ℃干燥3 h，冷却后即得，并精密称量，记录其重量(m2)，药材重量为M，根据以下公式计算天麻标准汤剂的出膏率，出膏率(ER%)=(m2-m1)×100/(M×V)×100%。

2.3 转移率

分别将“2.2”和“2.5.1”项下的天麻素和对羟基苯甲醇含量代入以下公式中，计算天麻标准汤剂中天麻素与对羟基苯甲醇的转移率，即转移率(%)=标准汤剂中指标成分的含量/药材中指标成分的含量×100%。

2.4 HPLC色谱条件

色谱柱为Agilent TC-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，UV检测器；采用乙腈与0.1%磷酸水溶液进行梯度洗脱，乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)，洗脱程序为0～11 min，3%～5%A；11～18 min，5%A；18～31 min，5%～14%A；31～38 min，14%A；38～48 min，14%～20%A；48～55 min，20%～24%A；55～75 min，24%～80%A；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为220 nm；柱温30 ℃；进样量为10 μL。

2.5 HPLC方法学考察

2.5.1 线性关系将天麻素标准品溶液与对羟基苯甲醇标准品溶液分别用甲醇稀释2、4、8、16、32、64倍，按照“2.4”项下色谱条件测定，进样量为10 μL，以各标准品浓度为横坐标(X)，波长220 nm下峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。天麻素线性方程为Y=327.85X-241.60，r=0.999 9；对羟基苯甲醇线性方程为Y=219.07X-229.18，r=0.999 8。

2.5.2 精密度考察取同一批天麻供试品溶液，按照“2.4”项下HPLC色谱条件进样6次，每次进样量为10 μL，测定其峰面积并记录，计算天麻素和对羟基苯甲醇峰面积RSD，均小于2.0%，满足含量测定要求，故精密度良好。

2.5.3 重复性考察 取同一批天麻药材样品，按供试品制备方法平行制备6份供试品溶液，按照HPLC色谱方法测定，进样量为10μL，天麻素和对羟基苯甲醇峰面积RSD均小于1.0%，说明该实验方法重复性良好。

2.5.4 稳定性试验 取天麻标准汤剂的供试品溶液，放置0、1、2、4、6、12、24 h后按照HPLC色谱条件进样10 μL，测定其峰面积变化并记录，24 h内天麻素和对羟基苯甲醇峰面积RSD均小于1.5%，符合测量要求，说明在24 h内天麻素与对羟基苯甲醇供试品性质稳定。

2.5.5 回收率考察平行量取同一批天麻供试品溶液6份，分别向其中加入天麻素、对羟基苯甲醇标准品0.05 mg、0.025 mg，混匀，按照HPLC色谱条件进样10 μL，记录天麻素和对羟基苯甲醇峰面积，并计算回收率，在90%～110%之间，说明此方法符合测定要求。

2.5.6 天麻素与对羟基苯甲醇含量测定 分别精密吸取15批天麻标准汤剂供试品溶液10μL，采用HPLC色谱仪测定并分析，记录波长在200 nm下天麻素和对羟基苯甲醇的色谱峰面积，代入标准曲线计算其相对含量。

3 结果

3.1 天麻标准汤剂出膏率的计算

按照“2.1”和“2.2”项下方法，制备天麻标准汤剂，并计算天麻15批药材标准汤剂的出膏率(见表2)。由表2可知，天麻15批药材标准汤剂的出膏率范围为10.5%～21.15%，平均值为16.47%，标准偏差为3.62%。

3.2 天麻标准汤剂中各成分转移率及含量测定

3.2.1 天麻药材含量测定按照“2.4”项下方法，测定15批天麻各成分含量，结果见表3。结果表明，15批天麻药材各成分含量均符合2015版《中华人民共和国药典》要求，且云南5批天麻饮片含量相对较高。

3.2.2 天麻标准汤剂各成分含量测定及转移率计算按照“2.4”项下方法，测定15批天麻标准汤剂中各成分含量，并计算其转移率，结果见表4。结果显示，天麻素含量范围为4.85 ～20.12 mg·g-1，均值为13.56 mg·g-1，标准偏差为4.667 mg·g-1，其转移率范围为22.67%～69.25%，均值为50.66%，标准偏差为12.31%。对羟基苯甲醇含量范围为4.28 ～14.38 mg·g-1，均值为7.91 mg·g-1，标准偏差为3.22 mg·g-1，其转移率范围为40.90%～89.48%，均值为60.62%，标准偏差为15.21%。

表3 15批天麻药材各成分含量

表4 15批天麻饮片标准汤剂的各成分含量及转移率

3.3 天麻标准汤剂指纹图谱

3.3.1 标识共有色谱峰 按照“2.4”项下方法，分别测定15批天麻药材标准汤剂的指纹图谱，并标识，记录其色谱信息，生成对照指纹图谱，见图1。

3.3.2 方法学考察 精密度、重复性及稳定性结果显示，所有共有峰相对保留时间RSD<1.0%，相对峰面积RSD<2.0%，且指纹图谱相似度均大于0.99，说明此指纹图谱测定方法中精密度满足要求，重复性良好，供试品在12 h内性质稳定，满足稳定性要求，可用于天麻标准汤剂指纹图谱的测定。

3.3.3 15批天麻标准汤剂指纹图谱 按照“2.4”项下方法，进行15批天麻标准汤剂指纹图谱的测定并进行合并对照，结果见图2。

图1天麻标准汤剂指纹图谱共有峰

图215批天麻标准汤剂指纹图谱

通过对比15批天麻标准汤剂指纹图谱，共发现7个共有峰，在对照指纹图谱过程中，以天麻素和对羟基苯甲醇色谱峰的保留时间和峰面积参比，计算各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积，结果见表5。通过中药指纹图谱相似度评价系统软件分析并计算，15批天麻标准汤剂相似度均符合指纹图谱要求。

表5 15批天麻共有峰相对保留时间及相对峰面积

4讨论

本实验选取5个产地的15批天麻药材，采用标准化工艺制备天麻标准汤剂，同时考察了天麻标准汤剂的质量，主要从以下3个方面进行质量控制：①药材基源的控制。选择具有代表性的道地药材，共15批，并进行鉴定，质量标准符合《中华人民共和国药典》2015版中各项指标要求。②标准汤剂的制备过程控制。制备过程统一标准化、规范化，如根据不同部位确定加水量等。所制得的15批天麻标准汤剂出膏率为(16.47±3.62)%，收率相对稳定，具有一定的代表性。天麻素转移率平均值为(50.69±12.31)%，对羟基苯甲醇转移率平均值为(60.62±15.21)%，不同产地差异较大，以云南产地相对较高。③标准汤剂的质量控制。采用中药指纹图谱与指标性成分含量测定相结合，既从整体上标识了标准汤剂的轮廓，又从成分定量上进行指认，明确标准汤剂的主要成分及在制备过程成分中的相对变化，进一步说明了标准汤剂的质量标准，为天麻及其他标准汤剂的质量控制研究提供了参考。

出膏率和转移率是考察制备工艺稳定或均一性的主要指标，而不同批次间的标准汤剂羿同是通过指纹图谱和含量测定来体现，对标准汤剂质量控制来说，优先考虑药典中药材或饮片所规定的指标成分。代云桃等[10]研究表明：若药典中规定的指标性成分转移率低或提取效率低，基本提取不出来，而标准汤剂中指标性成分含量极低，不适合作为评价指标，那么研究者需要在其他主要成分中重新选择，且要考虑指标性成分的水溶性，较脂溶性成分而言，水溶性成分提取效率更高，转移率更高。

天麻标准汤剂制备工艺是参照《中药配方颗粒质量控制与标准制定要求》(征求意见稿)[4]的要求，根据不同药用部位规定了相应的工艺参数，规范化建立天麻标准汤剂的制备工艺，从而对配方颗粒的相关研究有标准化指导作用，从根本上保证了质量的均一性和可控性，为配方颗粒的研究提供了参考标准。

天麻药材中的主要成分为天麻素和天麻多糖，在标准汤剂中，其他成分相对含量偏低，色谱峰小，且2015版《中华人民共和国药典》中以天麻素和对羟基苯甲醇为主要指标性成分来判断药材合格与否[11]，本实验对天麻素和对羟基苯甲醇含量进行了标定，其他共有峰在指纹图谱中进行定性标识。

指纹图谱是中药标准汤剂主要成分的有效控制手段，通过指纹图谱信息可反映标准汤剂制备过程中成分的变化或转移情况，本文对制备的15批天麻标准汤剂的7个共有峰进行相对保留时间和峰面积的计算，其中天麻素和对羟基苯甲醇相对保留时间和峰面积在批次间差异不大，峰面积百分比低于10%的共有峰的变化范围暂不要求。但峰面积百分比低于20%而高于10%的共有峰，其保留时间和峰面积在批次间差异相对较大，其可能原因有待进一步深入考察。