生殖营养方中多糖提取工艺研究

王秀文，裴晓丽，闫润红，卢乃木，宁 娜

(山西中医药大学 中药与食品工程学院，山西 晋中 030619)

五子衍宗丸补肾益精，主要用于肾虚精亏所致的阳痿不育、遗精早泄、腰痛、尿后余沥[1]。近年来研究发现，加味五子衍宗方及其有效成分总多糖(TP)能显著提高轻度认知障碍患者(MCI)的记忆能力，明显改善由东莨菪碱引起的小鼠记忆获得障碍[2]。但是作者发现，目前对五子衍宗丸多糖的研究较少，对其提取方法的研究则更少。贺福元等[3]采用超声提取法对不同批号的五子衍宗颗粒的多糖含量进行了测定，其平均含量仅为12.64%，而本研究报道的生殖营养方是在五子衍宗方的基础上添加了少量牛磺酸、食用氧化锌和松花粉等添加剂，并制成胶囊[4]。本实验采用4种不同的回流提取方法(水提法、醇提法、碱水提取法、碱醇提取法)制备生殖营养方多糖粗品，采用苯酚-硫酸法测定生殖营养方多糖的含量。通过比较多糖的提取率，为寻找较为适宜的生殖营养方多糖的提取工艺提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 实验药材及主要试剂

枸杞子、菟丝子(炒)、覆盆子、五味子(蒸)、盐车前子，这五味药均由北京同仁堂购买，并由山西中医药大学裴香萍副教授鉴定为正品；葡萄糖(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；氢氧化钠(分析纯，济宁市旭力化工有限公司)；氯仿(分析纯，北京市亚南伟业气体有限公司)；正丁醇(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；95%乙醇(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；苯酚(分析纯，济南华凯树脂有限公司)；浓硫酸(分析纯，青岛宝泽化工有限公司)。

1.2 实验仪器

UV-1600紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)；2NHW-Ⅱ型电热套(巩义市予体仪器有限公司)；HH-6型水浴锅(金坛市杰瑞尔电器有限公司)；GZX-9246MBE电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；LC-4012低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；CR双表双关SHB-D循环水式多用真空泵(上海豫康科教仪器设备有限公司)。

2 实验方法

2.1 葡萄糖对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的无水葡萄糖对照品0.2 g，加蒸馏水溶解并稀释至1 000 mL，精密吸取25 mL稀释至50 mL，配制成浓度为1.140×10-4mg·L-1的对照品溶液，放入冰箱中备用。

2.2 多糖供试液的制备

精密称取多糖约0.2 g，加入适量蒸馏水溶解，定量转移至50 mL量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，精密移取0.4 mL此溶液于10 mL量瓶中，加蒸馏水定容，即得。

2.3 生殖营养方多糖的提取方法

2.3.1 水提法 生殖营养方胶囊的制备方法在以前的研究中已有详述[4]，这里就不再赘述。取7粒生殖营养方胶囊，拆分，取生殖营养方胶囊内容物约2.0 g，精密称定，加入80倍的自来水，回流1 h。将提取液浓缩至65 mL，并冷却至室温，倒入分液漏斗中，用Sevag法(氯仿∶正丁醇=4∶1)去除蛋白，测得剩余提取液为51 mL，在搅拌的情况下加入3倍量的95%乙醇进行醇沉，醇沉时间为24 h，抽滤，沉淀用无水乙醇洗涤，并在室温下干燥，称重，置于干燥器中，备用。

2.3.2 醇提法 取7粒生殖营养方胶囊，拆分，取生殖营养方胶囊内容物约2.0 g，精密称定，加入80倍量30%的乙醇，回流1 h。从“将提取液浓缩至65 mL”开始，按照“2.4.1”项下方法制得生殖营养方多糖。

2.3.3 碱水提取法 取7粒生殖营养方胶囊，拆分，取生殖营养方胶囊内容物2.0 g，精密称定，加入80倍量pH=10～11的自来水，回流1 h，从“将提取液浓缩至65 mL”开始，按照“2.3.1”项下方法制得生殖营养方多糖。

2.3.4 碱醇提取法 取7粒生殖营养方胶囊，拆分，取生殖营养方胶囊内容物约2.0 g，精密称定，加入80倍量pH=10～11的30%乙醇，回流1 h，从“将提取液浓缩至65 mL”开始，按照“2.3.1”项下方法制得生殖营养方多糖。

3 实验结果

3.1 测定波长的选择

分别精密量取蒸馏水、浓度为1.140×10-4g·mL-1的葡萄糖对照品溶液和“2.2”项下制备的碱水提取的多糖溶液1.0 mL，分别置于10 mL的量瓶中，并加入5%的苯酚1.0 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0 mL，在冷水中放置10 min，用蒸馏水定容至10 mL，放置于冷水中显色15 min。在波长400～800 nm之间，对这三种溶液进行扫描。结果供试品与标准品溶液在490 nm波长处均有最大吸收，而空白溶液在此波长无干扰，故选用测定波长为490 nm。

3.2 葡萄糖标准曲线的绘制

分别精密移取“2.1”项下配制的1.14×10-4mg·L-1葡萄糖对照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 mL于10 mL量瓶中，分别加入蒸馏水至2 mL，分别加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，置于冷水中放置10 min，加蒸馏水定容，置于冷水中显色15 min。在490 nm的波长处测定各个试液的吸光度。以葡萄糖对照品溶液浓度(μg·mL-1)为横坐标，相应的吸光度(A)为纵坐标，进行线性回归分析，得葡萄糖标准曲线为：y=0.0218x+0.0821(r=0.999 7)，结果表明，葡萄糖在4.56～18.24 μg·mL-1范围内线性关系良好。

3.3 方法学考察

3.3.1 精密度试验 精密吸取1.14×10-4mol·L-1葡萄糖对照品溶液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，按“3.1”项下显色方法显色，测定6次，平均吸光度为0.578 2，吸光度的相对标准偏差RSD为0.56%，表明仪器具有良好的精密度。

3.3.2 稳定性试验 精密吸取碱水提取、按“2.2”项下方法所配制的多糖供试液1.0 mL，按“3.1”项下显色方法显色，分别于0、0.5、1、1.5、2.5、4、6、8 h测定吸光度(A)，考察其稳定性，吸光度的相对标准偏差RSD为0.86%，结果表明，在8 h内，样品具有良好的稳定性。

3.3.3 重复性试验 按照“2.3.3”项下方法制备多糖，精密吸取碱水提取、按照“2.2”项下方法所配制的多糖供试液1.0 mL，共6份，分别置于10 mL量瓶中，按“3.1”项下方法测量其吸光度(A)，吸光度的平均值为0.497 8，其RSD为1.9%。结果表明，所用方法具有良好的重复性。

3.3.4 加样回收率试验 取生殖营养方胶囊内容物1.0 g，精密称定，精密加入1.14×10-4g·L-1葡萄糖对照品溶液0.4 mL，按照“2.3.3”项下方法制备多糖6份，精密吸取按照“2.2”项下方法所配制的多糖供试液1.0 mL，共6份，并按“3.1”项下测定方法测定吸光度(A)，平均回收率为99.33%，RSD为1.9%。

3.4 样品测定

精密吸取按“2.2”项下方法制备的供试液1.0 mL，按照“3.1”项下方法显色并测定吸光度(A)，计算多糖的提取率，结果如表1所示。从表1可知，4种提取方法中，碱水提取法提取率最高，高达20.83%；而碱醇提取法提取率最低，仅为10.56%。其次，碱水提取法、水提法的提取率均高于醇提法和碱醇提取法的提取率，这可能是由于生殖营养方中水溶性多糖较多的缘故。另外，碱水提取法比传统的水提法的提取率高约4%，说明碱水提取法改进了生殖营养方多糖的提取方法。

4 结论

碱水提取法的提取率最高，可为生殖营养方多糖提取方法的研究提供参考。苯酚-硫酸比色法测定生殖营养方多糖简单方便、准确、可靠，且所需仪器简单、操作方便、显色稳定。

表1 多糖的提取率 (%，n=3)

5 讨论

5.1 料液比对多糖提取率的影响

本研究曾考察了料液比分别为1∶60、1∶80和1∶100对多糖提取的影响。发现当料液比为1∶60时，提取后溶液中沉淀较多，而料液比1∶80和1∶100时没有沉淀产生，且提取率较高。同时为了节约资源，我们选择1∶80的料液比。

5.2 乙醇浓度对多糖提取率的影响

本研究曾考察了不同乙醇浓度对多糖提取率的影响，乙醇浓度分别为15%、30%、40%、50%。当乙醇浓度40%和50%时，提取后发现提取液中会析出难溶性沉淀，影响多糖提取率，造成测定多糖含量时有很大误差。而乙醇浓度15%和30%提取过程中不会析出难溶性沉淀，且乙醇浓度30%的多糖提取率较高，因此选择乙醇浓度为30%。

5.3 碱水法提取多糖的优势和原因分析

多糖是极性大分子化合物，溶剂的酸碱性等对多糖提取具有较大影响。目前多采用不同温度的水和稀碱溶液提取，尽量避免在酸性条件下提取[5]。本实验采用水提法、醇提法、碱水提取法、碱醇提取法来提取多糖，发现碱水提取多糖的提取率最高，这可能是由于碱溶液对植物细胞起到破壁作用[6]，而且生殖营养方中水溶性多糖较多，使得多糖提取率提高。