分光光度法测定降血脂片中总皂苷含量的方法研究

高 宏，黄 婷，徐 慧

(江苏省理化测试中心，江苏 南京 210042)

降血脂片中的皂苷成分能够促进脂质代谢，使胆固醇及血中的脂蛋白的合成，分解转化以及排泄加速，从而降低血液中胆固醇、甘油三酯的同时还可以升高血清中的高密度脂蛋白胆固醇，达到降低动脉硬化，预防和治疗心脑血管病的目的。

现有国家标准及文献报道的皂苷的定量分析方法有高效液相色谱法[1]、液相色谱-串联质谱法[2]、分光光度法[3]等。高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法对实验条件要求较高，且只能测定特定的皂苷含量。分光光度法仪器成本低，操作简单，分析速度快。

近年来微波[4]和超声波[5]提取法被应用于中药化学成分提取，这两种方法操作简单，可大大缩短提取间。降血脂片中由于含有多种类型的皂苷，分别测定耗时耗力，因此可采用分光光度法，以人参皂苷Re为对照品，对总皂苷含量进行测定，用以进行产品质量控制。本文主要参考《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)[6]总皂苷测定方法，并对该方法进行优化和改进，可为保健食品中总皂苷含量测定提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

降血脂片(市售)；Amberlite-XAD-2大孔树脂(Sigma化学公司)；中性氧化铝(柱层析用，100～200目，国药集团化学试剂有限公司)；香草醛、甲醇、高氯酸、冰乙酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 仪器与设备

UV-1801紫外-可见分光光度计(北京瑞利分析仪器有限公司)；高性能通用台式离心机(赛默飞世尔科技有限公司)；KH2-250DB超声波清洗仪(昆山禾创超声仪器有限公司)；BSA224S-CW电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；BT25S高精密电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 人参皂苷Re标准曲线的制作

精密称取人参皂苷Re对照品0.25 g，用甲醇制成每1 mL含人参皂苷Re 2.5 mg的对照品储备溶液。精密吸取对照品储备溶液 0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80 mL 上清液分别置于10 mL容量瓶中，水浴挥干甲醇溶剂，加水溶解并定容至刻度，摇匀，作为系列标准溶液。用10 mL注射器作层析管，内装3 cm Amberlite-XAD-2大孔树脂，上加1 cm中性氧化铝。先用25 mL 70%乙醇洗柱，弃去洗脱液，再用25 mL水洗柱，弃去洗脱液，备用。精确加入1.0 mL系列标准溶液进行柱层析，先用25 mL水洗柱，弃去洗脱液，再用25 mL 70%乙醇洗脱总皂苷，收集洗脱液于蒸发皿中，置于60℃水浴挥干，以此作显色用。在上述已挥干的蒸发皿中准确加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，转动蒸发皿，使残渣溶解，再加0.8 mL高氯酸，混匀后移入5 mL带塞刻度离心管中，60℃水浴上加热10 min，取出，冰浴冷却后，准确加入冰乙酸5.0 mL，摇匀后，以1 cm比色皿于560 nm波长处进行比色。以人参皂苷标准品含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.2 试样溶液制备

将供试品研细混匀，通过40～60目标准筛，称取1.0 g左右的试样置于100 mL容量瓶中，加少量蒸馏水，经过不同方法提取后，再用水定容至100 mL，摇匀，于4000 r/min的离心机离心5 min，吸取1.0 mL上清液从“1.3.1吸取1.0 mL进行柱层析”起，同步以下操作，以1 cm比色皿于560 nm波长处进行比色。

1.3.3 降血脂片中总皂苷提取方法的选择

采取索氏提取法、超声波提取法两种不同提取方法来测试供试品中总皂苷的含量。精密称取3份1.0 g 制备好的供试品分别置于索氏提取器中，加入80 mL三氯甲烷，加热回流提取8 h后，将溶剂挥干，加水溶解并定容至100 mL容量瓶中备用[7]；另取3份1.0 g 制备好的供试品，分别置于锥形瓶中，加水约60 mL，超声30 min，用水定容至100 mL，摇匀，于4000 r/min的离心机离心5 min，取上清液备用。按照“1.3.1吸取1.0 mL进行柱层析”起，同步以下操作，以1 cm比色皿于560 nm波长处进行比色。

1.3.4 大孔树脂填装高度的选择

精密称取4份1.0 g 制备好的供试品，分别置于锥形瓶中，加水约60 mL，选定最佳提取条件，再用水定容至100 mL，摇匀，离心过滤后放置备用。分别通过大孔树脂填装高度为1、2、3、4 cm的柱层析，其他按照“1.3.1吸取1.0 mL进行柱层析”起，同步以下操作，以1 cm比色皿于560 nm波长处进行比色[8-9]。

1.3.5 重复性实验

精密称取1.0 g研细混匀的供试品7份分别置于100 mL 容量瓶中，选定最佳提取法和大孔树脂填充高度，按照“1.3.2试样溶液制备”测定项下操作，按照方法测定。

1.3.6 回收率实验

精密称取1.0 g研细混匀的供试品9份分别置于100 mL 容量瓶中，精密加入人参皂苷Re对照品储备溶液(2.5 mg/mL)体积分别为2、4和6 mL，每个浓度平行配制3份，按照“1.3.2试样溶液制备”测定项下操作，依法测定并计算加标回收率。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以人参皂苷Re含量为横坐标(x)，吸光度为纵坐标(y)，得线性回归方程：y=3.1313x+0.0034，相关系数R2=0.9994。表明人参皂苷含量在0～0.2 mg范围内，与溶液的吸光度值呈现良好的线性相关。

2.2 索氏提取法和超声波提取法效果比较

索氏提取法和超声波提取法得到的降血脂片中总皂苷的实验结果见表1。

由表1可知，索氏提取法和超声波提取法测得的总皂苷含量分别为1.18%、1.17%，但所用的前处理时间却相差较大。其中，索氏提取法回流提取时间为8 h，超声波提取时间为30 min，从提取时间及能源损耗等方面比较，超声波提取法操作简单快捷，故本方法采用超声波提取法来测定总皂苷含量。

图1 人参皂苷Re的标准曲线Fig. 1 Standard curve of ginsenosides

表1 降血脂片中总皂苷提取方法的选择

2.3 大孔树脂不同填装高度对总皂苷提取效果的影响

大孔吸附树脂是一类不含交换基团但有大孔结构的高分子吸附树脂。目前，大孔吸附树脂常用于皂苷类化合物、黄酮类化合物、生物碱类化合物等植物活性成分的分离纯化。它们是以大孔吸附树脂为吸附剂，通过适宜的吸附和解吸从而达到分离、提纯某一类或某一种化合物的目的[9]。本实验选定提取方法为超声波提取法，通过研究大孔树脂的不同填装高度进行试验，以确保达到总皂苷最佳提取效果。实验结果见图2。

由图2可知，当柱层析中大孔树脂填充高度为3 cm和4 cm时总皂苷提取率基本达到平衡，且提取率明显高于填充高度为1 cm和2 cm，从节约成本角度出发，本实验选定大孔树脂填充高度3 cm为最佳实验条件。

2.4 重复性实验

通过上述实验结果得知，选定超声波提取法和大孔树脂填充高度3 cm为最佳实验条件，在该条件下测得供试品中总皂苷的含量均值为1.17%，相对标准偏差(Relative standard deviation, RSD)为1.8%。结果表明本实验方法重复性良好，结果见表2。

图2 大孔树脂不同填装高度对中总皂苷提取效果的影响Fig. 2 Effect of different filling height of macroporous resin on extraction of total saponins

表2 重复性实验结果

2.5 回收率实验

通过计算得出，低、中、高 3个浓度的平均加标回收率分别为: 96.4%、98.4%和 99.0%，相对标准偏差分别为2.0%、1.5%和1.6%，满足实验要求，结果见表3。

表3 加标回收实验结果

3 结论与讨论

皂苷类物质具有一定的生物活性，可用于食品添加剂、保健食品、化妆品中，建立一种简便、可靠的测定方法十分必要[10-11]。香草醛-高氯酸法是苷类化合物测定时最广泛采用的显色法，本文配制不同浓度的人参皂苷对照品溶液建立标准曲线，通过在标准曲线上查得的供试品溶液中皂苷浓度计算得出降血脂片中总皂苷的含量。本研究表明采用超声波提取法提取人参皂苷工艺具有提取成本低、安全、快捷等优点，同时大孔树脂填充高度为3 cm时具有最佳提取得率，供试品中总皂苷测定重复性和加标回收率均良好。