贵州野生多穗柯根皮苷提取工艺研究

王代波，代亮亮，李冰晶，赵景芳，罗丽平，徐 青

(贵州省生物研究所，贵州 贵阳 500009)

多穗柯(LithocarpuspolystachyrusRehd.)[1]，壳斗科栎属乔木，在贵州被称作“甘茶”，俗称甜茶，有茶、糖、药三种功能，是西方发达国家正在寻找的一种具有良好保健功能且适合肥胖人群和糖尿病人群使用的替代糖类的珍贵野生资源植物。多穗柯以野生状态分布于我国长江以南各省区海拔400 m以上的低山密林中，湖南雪峰山一带分布最广，贵州等西南几个省区也发现有大量野生资源。多穗柯作为药食资源在中国已有千年历史，其嫩叶制茶，色泽鲜翠，透亮晶莹，有生津止渴、消除疲劳、清热化痰、解暑之功效[2]，还可用于治疗肺热咳嗽、高血压、湿热痢疾、皮肤瘙痒、痈疽疮疡等[3]。多穗柯的主要化学成分是黄酮类和三萜类。黄酮类中的二氢查耳酮类的甜度是葡萄糖的300倍，是多穗柯主要的甜味物质，主要成分是根皮苷、三叶苷和3-羟基根皮苷，主要分布在多穗柯叶片中[4-8]。三萜类主要成分为齐墩果烷、达玛烷、环菠萝蜜烷类等物质[9]，在叶、茎中均有分布。研究发现，多穗柯具有“三降”(降血压、降血糖、降血脂)[10-13]、“三抗”(抗氧化、抗过敏、抗癌变)、改善记忆力等生物活性[14-16]。多穗柯根皮苷不仅甜度高，还有很强的生物活性，具有很高的开发利用价值。本研究通过正交试验优选最佳超声辅助提取根皮苷的工艺条件，为多穗柯根皮苷制备及其产品开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生多穗柯叶片(采自贵州罗甸)、纯水、乙醇、根皮苷对照品(纯度>98%，批号：GT67195，酷尔化学科技有限公司)。

1.2 仪器与设备

JEA502型中药粉碎机(北京市泰和格润仪器有限公司)；FW135/FW200电子天平(上海谱春计量仪器有限公司)；KQ-800DE超声波仪器(昆山市超声仪器公司)；SHIMADZU UV-1750紫外分光光度计；800电动离心机(上海梅香仪器有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 根皮苷检测方法

用分析天平精确称量根皮苷标准品样品6.0 mg，用甲醇完全溶解后，定容于50 mL容量瓶中，得到浓度为0.1 mg/mL的根皮苷标准溶液。分别取0.5、1、1.5、2、2.5、3.0 mL的0.12 mg/mL的根皮苷标准溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容。用0.018 mg/mL的根皮苷标准溶液进行扫波，确定其最大吸收波长为284 nm。按照上述检测方法在284 nm处测定吸光值。得根皮苷浓度Y(mg/mL)与吸光度X的回归方程：Y= 31.02X+ 0.0253，R2= 0.9995。

1.3.2 提取工艺

多穗柯叶片60℃烘箱烘干，利用超微粉碎机对叶片进行粉碎得粗粉，过筛(2号筛，24目)，得多穗柯叶片细粉样品。准确称取5.0 g多穗柯样品于250 mL锥形瓶中，采用浓度为50%的乙醇溶液作为提取液，以超声波辅助法提取多穗柯根皮苷，分别在不同的超声波功率、提取时间、料液比、提取温度条件下提取多穗柯根皮苷，提取结束后，抽滤得提取液，取定量提取液稀释、定容，过膜测定根皮苷吸光值。

1.3.3 单因素试验

提取时间对提取率的影响 采用50%乙醇为提取液。提取条件：提取温度50℃、提取功率800 W、料液比1∶30。提取时间采用15 min、30 min、45 min、60 min、75 min。测定根皮苷吸光值、计算得率。选取较适宜提取时间。

提取温度对提取率的影响 采用50%乙醇为提取液。提取条件：较适宜提取时间、提取功率800 W、料液比1∶30。提取温度采用15℃、30℃、50℃、65℃、80℃。测定根皮苷吸光值、计算得率。选取较适宜提取温度。

提取功率对提取率的影响 采用50%乙醇为提取液。提取条件：较佳提取时间、较佳提取温度、料液比1∶30。采用480 W、560 W、640 W、720 W、800 W。测定根皮苷吸光值、计算得率。选取较适宜提取功率。

料液比对提取率的影响 采用50%乙醇为提取液。提取条件：较佳提取时间、较佳提取温度、较佳提取功率。采用料液比1∶10、1∶30、1∶50、1∶70、1∶90。测定根皮苷吸光值、计算得率。选取较适宜提取料液比。

1.3.4正交实验

根据单因素实验的结果，设计4因素(提取时间、提取温度、提取功率、料液比)3水平L9(34)正交实验。根据正交实验结果分析不同因素影响甘茶根皮苷提取得率的主次顺序得出较佳提取工艺条件。

1.3.5验证实验

按照1.3.4最佳工艺参数重复3次实验，考察重复性和稳定性。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 提取时间对提取率的影响

提取时间对多穗柯根皮苷提取得率的影响如图1所示，提取时间少于50 min时，根皮苷得率与提取时间呈正相关。提取时间多于50 min时，根皮苷得率与提取时间呈负相关。图中在提取时间在50 min时，显示为提取得率峰值，故选择50 min为较佳提取时间。

图1 不同时间提取根皮苷得率Fig. 1 The effect of time on the extraction rate of phloridzin

2.1.2 提取温度对提取率的影响

提取温度对多穗柯根皮苷提取得率的影响如图2所示，提取得率在提取温度50℃时取得峰值，提取温度<50℃时，温度越高，得率越高。提取温度>50℃时，温度越高，得率越低。故取50℃为较佳提取温度。

图2 不同温度提取根皮苷得率Fig. 2 The effect of temperature on the txtraction rate of phloridzin

2.1.3 提取功率对提取率的影响

提取温度对多穗柯根皮苷提取得率的影响如图3所示，当提取功率为720 W左右取得最大提取得率。取720 W为较佳提取功率。

图3 不同功率提取根皮苷得率Fig. 3 The effect of ultrasonic power on the extraction rate of phloridzin

2.1.4 料液比对提取率的影响

料液比对多穗柯根皮苷提取得率的影响如图4所示，当料液比>1∶30时，料液比越大，提取得率越低。当料液比<1∶30时，料液比越大，提取率越高。料液比为1∶30时取得最高提取率，故1∶30为较佳料液比。

图4 不同料液比提取根皮苷得率Fig. 4 The effect ofsolid liquid ratio on the extraction rate of phloridzin

2.2 正交实验结果与分析

根据单因素试验出的最适宜提取条件，进行4因素(A：提取时间/min、B：提取温度/℃、C：提取功率/W、D：料液比)三水平L9(34)正交试验，因素水平表如表1所示，重复三次实验取均值，结果如表2所示，四因素极差满足RA>RB>RC>RD，表明以50%乙醇为提取液时，影响多穗柯根皮苷提取得率的因素依次为提取时间、提取温度、提取功率、料液比，且较优提取条件为A2B2C2D2，即以50%乙醇为提取液时，超声波辅助提取贵州野生多穗柯根皮苷的最佳条件为提取时间50 min、提取温度50℃、提取功率720 W、料液比1∶30。表3方差分析结果显示提取时间和提取温度对多穗柯根皮苷提取率有显著性影响。

表1 L9(34)因素水平表

表2 L9(34)正交实验直观分析表

表3 L9(34))正交实验方差分析表

2.3 最佳提取条件验证试验

按正交试验得出的较优提取条件重复3次试验，多穗柯根皮苷提取得率分别为1.376%、1.384%、1.396%，平均得率1.385%，SD为0.10%，RSD为0.726%，表明工艺稳定、可重复性强。

3 结论与讨论

本研究探究了以50%乙醇为提取液超声波辅助提取多穗柯根皮苷的方法，优选出较优提取工艺条件为：提取时间50 min、提取温度50℃、提取功率720 W、料液比1∶30。此工艺经过验证试验表明稳定性好、重复性高。通过方差分析表明提取时间和提取温度对提取率有显著影响。实验中各因素对多穗柯根皮苷提取率的影响从大到小依次为提取时间、提取温度、提取功率、料液比。用超声波辅助提取贵州野生多穗柯时，提取时间对提取率影响最大，提取时间小于50 min时，根皮苷得率与提取时间呈正相关。提取时间大于50 min时，根皮苷得率与提取时间呈负相关。所以50 min是较适宜提取时间，采用此条件能提升多穗柯提取率。此外，超声波辅助可快速破坏植物细胞的细胞壁和细胞膜，溶剂迅速进入细胞，加快有效成分的浸出，并保持生物活性，从而提升多穗柯利用价值。