近日节律紊乱影响大鼠更年期综合征的心理生理学观察

黄 蓉，吴庆庆，李光建，祝金津，汪萌芽

(皖南医学院 1.细胞电生理研究室；2.启明星小组，安徽 芜湖 241002)

更年期综合征(climacteric syndrome，CMS)是围绝经前后妇女因卵巢功能逐渐衰退以致雌激素水平下降，引起的以植物神经功能紊乱代谢障碍为主的一系列症候群[1]。研究表明[2]近日节律紊乱对于女性的身心也有不良影响，但对更年期综合征的影响未见报道。故本研究通过在体同步记录技术记录观察更年期综合征大鼠在近日节律紊乱影响下相关核团室旁核(PaPo)和视交叉上核(SCh)的电活动及各项生理指标的变化，以探讨近日节律紊乱是否对CMS模型大鼠产生影响及CMS的心理生理学机制，为CMS治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 浙江省实验动物中心提供35只(257±23)g育龄未孕雌性SD大鼠，随机均分为CMS组(模型组)、近日节律紊乱组、模型+近日节律紊乱组、假手术组和正常组。

1.2 仪器和药品 PowerLab八通道生理信号采集系统及其Chart Pro分析软件(AD Instruments，Australia)、生物电放大器(美国A-M Systems，MODEL 1800)、脑立体定位仪和保温毯系统(上海奥尔科特生物科技有限公司)、电生理屏蔽罩、防震台、20%乌拉坦、玻璃微电极和金属参考电极等。

1.3 造模

1.3.1 模型和假手术 10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠后,背部摘除模型组和模型+近日节律紊乱组卵巢[3]；摘除假手术组卵巢周围脂肪组织[4]。

1.3.2 近日节律紊乱[5]近日节律紊乱组和模型+近日节律紊乱组放于近日节律紊乱箱，白炽灯光照两周。

1.4 模型鉴定 吕氏美兰染色法[6]检测各组大鼠的阴道涂片鉴定造模成功率。术后3 d对各组大鼠连续5 d(早晚各1次)阴道脱落细胞涂片，观察有无发情迹象(观察角化上皮细胞、有核上皮细胞和白细胞3种细胞比例)，无发情期即造模成功[7]。

1.5 心理生理学记录与分析方法

1.5.1 外周多项生理指标的同步记录 20%乌拉坦(1.5 g/kg)腹腔注射麻醉大鼠后将大鼠俯卧位固定在配有恒温(37℃)保温毯的脑立体定位仪上，在右前肢腕关节和左后肢踝关节上部的皮下插入针式电极，记录标准肢体Ⅱ导联心电图，右后肢针式电极接地；在右侧腋中线第9肋下缘肋间外肌插入两根针式电极，记录呼吸肌肌电图。

1.5.2 细胞外脑内双核团记录及鉴定[8]大鼠咬合门齿杆后，插入耳杆并保持左右对称，固定头部后手术刀划开头皮，用3%H2O2擦至颅骨前囟、人字缝显示，调节两者水平面一致。定位情况如下，PaPo，AP:-2.04～-2.28 mm,ML:0.1～1.55 mm,DV:7.9～8.05 mm；SCh，AP:-0.48～-0.60 mm，ML:0～0.42 mm，DV:8.9～9.3 mm[9]。冷光源照明下，牙科钻钻颅开窗，弯针头挑破硬脑膜、蛛网膜和软脑膜，操作臂牵引玻璃电极(内含滂胺天蓝)紧贴脑组织，放好参考电极及接地电极，记录电极接入记录放大系统后，缓慢下至目标脑区寻到明确、合适的细胞外放电信号，双核团及外周多项生理指标信号稳定后，记录20 min并存盘。实验结束后，4%PFA固定鼠脑再冠状面切片观察标记位置，鉴定记录位点(图1)。仅将记录位点正确的样本纳入结果的统计和分析。

左：PaPo；右：SCh。

图1 双核团定位图

1.5.3 信号采集及分析[10-11]用Chart 5软件采集、存盘各项信号，心电为低通200 Hz、高通10 Hz，采样频率4 kHz，呼吸肌肌电为低通200 Hz、高通0.1 Hz，PaPo和SCh为高通1 Hz、低通5000 Hz。对核团记录电信号原始数据分析放电频率。对核团放电原始数据带宽滤波得各神经振荡信号：delta(1～4 Hz)，theta(4～10 Hz)，beta(10～30 Hz),gamma(30～80 Hz)，fast(80～200 Hz)，用FFT功能分析各神经振荡的能量。使用直接计数法对呼吸频率进行统计。用记录一段时间内心率的平均值代表心率值。

2 结果

2.1 模型鉴定 连续5 d每天上午9时和下午4时检测观察各组大鼠阴道涂片(图2)以鉴定是否处于动情周期的动情期阶段[12]，涂片结果可知模型组未处于动情期，造模成功。

从左至右分别是正常组、假手术组、模型组、近日节律紊乱组和模型+近日节律紊乱组。

图2 阴道涂片图(标尺:50 μm)

2.2 核团放电活动

2.2.1 核团放电活动的记录 PaPo和SCh细胞外电活动、心电(ECG)、呼吸肌电(EMG)记录(图3),分波段进行带宽滤波则得到各神经振荡记录(图4)。

2.2.2 核团放电频率的比较 在PaPo放电频率上(图5)，模型组、近日节律紊乱组、模型+近日节律紊乱组高于假手术组和正常组(P<0.05或P<0.01)。在SCh放电频率上(图5)，正常组低于其余4组(P<0.01)(图6)。

2.2.3 神经振荡能量的比较 在PaPo核团比较上(表1)，beta和fast振荡能量上模型组高于其余4组(P<0.05)。在SCh核团比较上(表2)，delta和theta振荡能量上假手术组高于其余4组(P<0.05)。

2.2.4 核团放电频率的相关性分析 对5组PaPo和SCh的放电频率进行直线相关分析(图7)，模型+近日节律紊乱组PaPo和SCh呈高度正相关(图7E，r=0.902,P=0.014)，与其余4组基础放电频率相关系数差异有统计学意义(P<0.01)，正常组基础放电频率相关系数呈弱相关或无相关(图7A，r=0.076,P=0.342)，与其余4组基础放电频率相关系数差异有统计学意义(P<0.01)。

从上往下依次为PaPo(mV)、SCh(mV)的生物电信号，ECG(mV)和EMG(mV)。

图3 近日节律紊乱组脑内双核团细胞外电活动和外周生理指标同步记录图

从上到下依次为delta、theta、beta、gamma、fast波段的神经振荡(mV)。

图4 近日节律紊乱组双核团神经振荡同步记录

A:PaPo，B:SCh，横坐标为截取的放电信号时间长度，纵坐标为放电频率。

图5 模型组双核团的放电频率直方图

1.模型组;2.近日节律紊乱组;3.模型+近日节律紊乱组;4.假手术组;5.正常组;

图6 5组双核团的放电频率比较

组别ndeltathetabetagammafast正常组6802±809420±477510±6322168±2482229±227假手术组71276±2799757±17371381±2438*5177±1083910557±26121*模型组62567±24102032±16527298±6808#28586±40924143083±214744#近日节律紊乱组71426±33861131±24311215±2624*1845±26713378±180*模型+近日节律紊乱组6903±640423±320758±1082*4203±42671279±1542*F0.5351.0654.2012.3032.755P0.7110.3930.0090.0840.048

*与模型组比较：P<0.05；#与正常组比较：P<0.05。

组别ndeltathetabetagammafast正常组6707±695257±285207±1872795±355382±521假手术组73218±2763#1394±1350#3542±47196125±88177024±15881模型组6820±741△506±547△2026±33969225±1357886065±157284近日节律紊乱组7692±1003△285±379△242±2825096±11756414±453模型+近日节律紊乱组6817±561△248±177△177±154499±543541±312F3.8293.1932.1400.7851.860P0.0140.0290.1030.5450.147

△与假手术组比较：P<0.05；#与正常组比较：P<0.05。

A：正常组；B：假手术组；C：模型组；D：近日节律紊乱组；E：模型+近日节律紊乱组。

图7 5组PaPo和SCh放电频率的相关性分析

2.3 外周生理指标比较 生理指标各组相似(P>0.05)。

3 讨论

研究表明室旁核是雌激素的关键核团[13]和下丘脑重要的神经内分泌核团。视交叉上核是生物节律中枢[14]。研究表明促觉醒环路的成员含室旁核[15]。室旁核放电频率结果显示，模型组和模型+近日节律紊乱组比假手术组和正常组放电频率高，即证明CMS模型的成功，也提示生物节律对室旁核有一定影响。另视交叉上核放电频率结果显示，正常组低于其余4组，表明近日节律紊乱模型成功。基于手术后褪黑素分泌紊乱[16]，在结果中假手术组高于正常组，证明术后对节律有影响。双核团放电频率比较发现模型+近日节律紊乱组与近日节律紊乱组、模型组比较均无差异，说明更年期综合征和近日节律紊乱是两个独立因素，各自产生影响。

鉴于大脑在不同时空尺度的局部场电位、脑电等神经电生理活动信息的传递与交流机制的研究[17]。故探究雌激素分泌相关脑区[13]的神经振荡的影响中，模型组的beta和fast振荡能量显著高于其他组别。由于beta振荡主要调节运动系统中动作电位的时间同步性[18]，是抑制运动的振荡[19]。女性更年期易发多种疾病,包含骨质疏松症[20]，其会阻碍运动，进一步佐证了模型组会增加beta振荡能量且高于其余4组。fast振荡多研究应用于癫痫疾病[21]，研究表明雌激素具有延迟癫痫发作的作用[22]，故双侧卵巢摘除后雌激素水平下降，相关脑区的fast振荡能量会高于其余4组。手术是一种应激原,因术后疼痛及并发症等原因,患者睡眠质量常受到影响[23]，delta振荡和theta振荡与睡眠相关，在探究生物节律相关脑区[14]的神经振荡影响时，手术确实显著增加了delta和theta振荡能量。

结果显示正常组PaPo和SCh放电频率基础值之间相关性弱，与其余4组差异均有统计学意义，表明正常组在这几种条件刺激下会提高PaPo和SCh的正相关关系；模型+近日节律紊乱组PaPo和SCh放电频率基础值之间相关性强，与其余4组差异均有统计学意义，可见近日节律紊乱可能通过改变PaPo和SCh的相关性而影响CMS的心理生理学特征。但是引起PaPo和SCh相关关系发生改变的具体机制，需要进一步实验阐明。综上暗示了CMS对大鼠心理和生理方面的影响，也为进一步关注夜班人员的身心健康和CMS治疗提供理论依据，为室旁核和视交叉上核的进一步密切关系研究奠定基础。