管碟法测定万州红桔精油抑菌效果研究

向春艳 胡悦

摘 要：采用超声波提取法提取万州红桔精油，通过管碟法测定红桔精油对6种试验菌的抑菌效果，用二倍稀释法测得其最低抑菌浓度。结果表明：红桔精油对6种试验菌均有不同程度的抑制作用，其中对单核细胞增生李斯特氏菌的抑菌作用最强，对大肠埃希氏菌和短小芽孢杆菌的作用次之。阪崎肠杆菌、白色念珠菌和大肠埃希氏菌的最低抑菌浓度为12 μL·mL-1;短小芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为24 μL·mL-1。

关键词：万州红桔;精油;抑菌效果

Abstract：Wanzhou tangerine essential oil was extraction by ultrasonic extraction， determination of bacteriostatic effect of essential oil of tangerine on 6 kinds of experimental bacteria by cylinder-plate method ， determination of the minimum inhibitory concentration by double dilution method. The results show that： the essential oil of tangerine inhibited the growth of six kinds of experimental bacteria in varying degrees， among them， Listeria monocytogenes has the strongest antibacterial effect， the effect on Escherichia coli and  Bacillus pumilus was the second. The minimum inhibitory concentrationfor Escherichia coli， Candida albicans and Escherichia coli was 12 μL·mL-1， and the minimum inhibitory concentration of Bacillus pumilus， Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus was 24 μL·mL-1.

Key words：Wanzhou tangerine; Essential oil; Antibacterial effect

中圖分类号：S666.2

柑橘（Citrus reticulate Blanco）是芸香科植物。万州红桔古称丹桔，是柑橘属的一个重要品种，是中国国家地理标志产品。红桔皮中含有挥发油，可制备精油，有研究表明，柑橘精油具有很好的抑菌效果[1-2]，

广泛应用于食品、化妆品、烟酒制品、医药制品等行业[2]。在当代食品行业，为了保证食品不被微生物污染，添加防腐剂、保鲜剂等仍是最常用的手段，但化学添加剂的蓄积会对人体造成健康风险，而取材天然的橘皮精油，不仅具有良好的抗菌作用，安全性也非常高，可用于开发新型抑菌剂，未来市场前景非常好。本实验以万州红桔皮为原料提取精油，通过管碟法测量万州红桔精油对大肠埃希氏菌等6种试验菌的抑菌作用，确定最低抑菌浓度，为今后开发万州红桔新产品，提高红桔产业的综合应用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大肠埃希氏菌（ATCC25922）、阪崎肠杆菌（CMCC45401）、短小芽孢杆菌（CMCC63202）、金黄色葡萄球菌（CMCC26003）、单核细胞增生李斯特氏菌（ATCC19115）以及白色念珠菌（ATCC10231）均来源于广东省微生物菌种保藏中心。

万州红桔购自重庆市万州区沪万农贸市场。

营养琼脂（广东环凯微生物科技有限公司）;改良马丁琼脂（青岛海博生物技术有限公司）;石油醚（30～60 ℃，分析纯，成都市科隆化学品有限公司）;氯化钠（分析纯，重庆川东集团有限公司）;95%乙醇（分析纯，重庆川东集团有限公司）。

1.2 仪器与设备

电子天平（AB204-S，梅特勒-托利多国际贸易上海有限公司）;电热恒温水浴锅（SSY-H，上海三申医疗

器械有限公司）;立式压力蒸汽灭菌锅（LDZH-100KBS，上海申安医疗器械公司）;生物安全柜（BHC-1300ⅡA2，苏州安泰空气技术有限公司）;电热恒温培养箱（DHP-9272型，上海益恒实验仪器有限公司）;霉菌培养箱（MJ-150-I，上海齐欣科学仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 红桔精油的提取

称取新鲜破碎的万州红桔果皮15.0 g，加入60 mL石油醚，浸泡30 min，80 W超声功率下超声60 min，过滤，滤液置蒸发皿中于60 ℃恒温水浴锅中挥发干溶剂，得到红桔精油。

1.3.2 红桔精油抑菌试验

①培养基及试剂的制备。分别配制营养琼脂、改良马丁琼脂、生理盐水备用。②菌悬液的制备。细菌接种于营养琼脂斜面，于36 ℃下培养，真菌接种于改良马丁琼脂斜面，于28 ℃下培养，24 h后取出，用无菌生理盐水洗下菌苔，经平板计数后得到菌含量约为4.0×107 CFU·mL-1的6种菌悬液，备用。③管碟法测定抑菌圈。吸取6种待测菌悬液各0.1 mL，均匀涂布于相应的琼脂平板上，静置5 min，等待菌液吸收。取无菌镊子将内径为6 mm的4个灭菌小钢管置于平板上，2个加15 μL红桔精油原液，另2个加15 μL无菌生理盐水作为空白对照，每种菌做3个平板，盖上陶瓦盖，置于适宜的温度下培养24 h。测量抑菌圈直径，取平均值作为结果。④最低抑菌浓度（MIC）的测定。用50%乙醇将红桔精油的体积浓度稀释成6、12、24、48μL·mL-1与96 μL·mL-1[3-4]，备用。吸取6种待测菌悬液各0.1 mL，均匀涂布于相应琼脂平板上，静置5 min，等待菌液吸收。取无菌镊子将6个灭菌小钢管置于平板上，1个小钢管加入15 μL的50%乙醇作为空白对照，另5个分别加入上述5种稀释后的红桔精油各15 μL，盖上陶瓦盖，置于适宜的温度下培养24 h。测量抑菌圈直径，最小抑菌圈对应的体积浓度即为该菌的MIC。

2 结果与分析

2.1 抑菌圈直径测定结果

由表1可知，本实验所用红桔皮精油对单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌和短小芽孢杆菌的抑制作用较强，其抑菌圈直径均在10 mm以上，而对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌的抑制作用较弱，抑菌圈的直径均在10 mm以下。

2.2 最低抑菌浓度（MIC）测定结果

根据表2可知，当精油体积浓度为6 μL·mL-1时，对短小芽孢杆菌完全没有抑制作用，对其余5种试验菌稍有抑制作用，但不明显;当体积浓度为12 μL·mL-1时，对大肠埃希氏菌、阪崎肠杆菌和白色念珠菌有明显的抑制作用;当体积浓度达到24 μL·mL-1时，才能对金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌和短小芽孢杆菌产生抑菌作用。

3 讨论

目前抑菌效果的測定常用纸片法，本实验参考管碟法测定药品抗生素效价，用小钢管代替纸片，能准确定量加入的精油，操作简单易行，能有效保障试验结果的准确性。

本实验所加入的精油量为15 μL，能刚好润湿直径为6 mm的滤纸片，菌体含量比陈林林[5]等的研究中高，这可能是导致本实验中抑菌圈直径相对较小的原因之一。

本实验所用万州红桔皮精油采用超声波辅助提取法制取，今后可考虑采用不同方法提取，并做成分分析及抑菌试验，为有效利用精油开发产品提供有力的理论支撑[6]。

参考文献：

[1]李巧巧，雷 激，唐 洁，等.商品柑橘精油的抑菌性及其应用研究[J].食品与机械，2011，27（6）：160-162.

[2]崔佳韵，梁建芬.柑橘属植物果皮精油抑菌作用研究进展[J].粮油食品科技，2018，26（1）：35-39.

[3]韩 林，夏 兵，丁博等.川佛手精油抗氧化及抑菌活性的研究[J].中国调味品，2014，39（12）：55-62.

[4]徐 蜜.柠檬草精油成分分析与抑菌活性研究[D].长沙：中南林业科技大学，2015.

[5]陈林林，米 强，辛嘉英.柑橘皮精油成分分析及抑菌活性研究[J].食品科学，2010，31（17）：25-28.

[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015.