长效土霉素注射液的急性毒性及肌肉刺激性研究

任含柳,路美玉,段鹏,黄月辉

(华北制药集团动物保健品有限责任公司，石家庄 050000)

长效土霉素注射液属四环素类抗生素，具有广谱抗菌作用，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、衣原体、支原体及立克次体均有效，临床也常用于治疗附红细胞体等病，并且能够维持较长有效血药浓度时间。其作用机制主要在于药物可以特异性地与核糖体30S亚基的a位置结合，从而阻止氨基酰-tRNA在该位置上的联结，进而抑制肽链的增长和影响细菌或其他病原微生物的蛋白质合成。20世纪美国辉瑞制药公司率先开发成功长效土霉素注射液，其商品名为“得米先”，上市后迅速得到普及。近些年来，我国也成功研制出了长效土霉素注射液，但同国外产品相比仍有较大的差距，主要表现在稳定性差、工艺控制难等问题[1]，这就大大降低了国内相关产品的市场竞争力[2]。为提高长效土霉素注射液的缓释作用，同时克服长效土霉素注射液的稳定性缺陷，本文通过预试验筛选有机复合溶剂、缓释剂、抗氧剂、稳定剂及pH调节剂，确定采用α-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺、聚乙烯吡咯烷酮K30等有机溶媒，经过特殊工艺制备，得到一种新型的长效土霉素注射液。前期试验表明，该长效土霉素注射液成本低、稳定性好[3]。为探讨该长效土霉素注射液的急性毒性及刺激性，本研究分别进行了小鼠急性毒性和家兔局部刺激性试验，以期为临床应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验药品 长效土霉素注射液，由华北制药集团动物保健品有限责任公司研发部实验室制备。均用灭菌生理盐水稀释至适宜倍数后使用。

1.2 试验动物及管理 选取60只健康昆明种小白鼠(雌雄各半)，体重为19±2 g，试验动物及饲料均购自沈阳市双义试验动物研究所。选取27只健康成年家兔(雌雄各半)，体重为2.0～2.5 kg，试验动物及饲料均购自新疆医药大学实验动物中心。

1.3 方法

1.3.1 小鼠急性毒性试验 试验实施时间为2018年9月10日至2018年9月17日，试验场地为石家庄市某大学实验室。随机将60只小白鼠分为6组，每组10只，其中雌雄各半。根据预试验初步确定出LD0和LD100分别为408.7、759.7 mg/kg，确定正式试验分别以408.7、462.6、523.7、592.9、671.1、759.7 mg/kg的剂量，给小白鼠按照0.1 mL/10 g进行颈部肌肉注射。试验期为7 d，各组以相同日粮及饮水常规饲养。

1.3.2 家兔局部刺激性试验 试验实施时间为2018年9月15日至2018年9月29日，试验场地为石家庄市某大学实验室。随机将27只家兔分为3组，每组9只。左侧股四头肌部位剪去兔毛，用75%乙醇和2%碘酊消毒后，分别在第一组成年家兔的左侧后股四头肌处注射灭菌生理盐水1.00 mL作对照，在第二组成年家兔的左侧后股四头肌处注射长效土霉素注射液0.5 mL，在第三组成年家兔的左侧后股四头肌处注射长效土霉素注射液1.00 mL。试验期为15 d，各组以相同日粮及饮水常规饲养。

1.4 样品采集及处理

1.4.1 急性毒性试验 小白鼠颈部肌肉注射长效土霉素注射液后，观察7 d并记录每组临床症状和死亡情况，随机解剖5只小白鼠进行取样，观察肝脏、肾脏、心脏等内脏器官的变化情况。本试验采用改良寇氏法[4]。按照毒理学分级标准进行评定。

1.4.2 刺激性试验 成熟家兔注射后，每组分别于给药后2、7、15 d各处死3只，解剖后取股四头肌，纵向切开。观察注射部位肌肉组织的变化。

本试验采用成年家兔股四头肌法。按照肌肉组织刺激反应的评定标准[5]进行评定， 0级刺激反应，给药部位无明显反应；1级刺激反应，给药部位轻度充血，直径0.5 cm以下；2级刺激反应，给药部位中度充血，直径1.0 cm以下；3级刺激反应，给药部位中度充血，红肿，肌肉有变性；4级刺激反应，出现肌肉褐色变性，坏死0.5 cm以下；5级刺激反应，肌肉严重变性，出现大片坏死。

1.5 数据分析 数据处理采用SPSS 17软件进行One-Way ANOVA 方差分析，并用 Duncan 法进行多重比较，以P<0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 急性毒性试验 结果如表1所示。

表1 长效土霉素注射液急性毒性试验小白鼠死亡数(n=10)

由表1 可知，试验小白鼠共6组，每组10只。6组小白鼠给药剂量分别为408.7、462.6、523.7、592.9、671.1、759.7 mg/kg，观察7 d后，各组死亡数(死亡率)分别为0只(0%)、2只(20%)、3只(30%)、4只(40%)、6只(60%)、9只(90%)。随着给药剂量的增大，小白鼠死亡数量逐渐增多。

表2 长效土霉素注射液急性毒性试验

LD50为半数致死量

由表2可知，该新型长效土霉素注射液的LD50为600.32 mg/kg，LD50的95%的可信区间为(600.32±2.44)mg/kg。

2.2 局部刺激试验 眼观给药后2、7、15 d，颈部注射部位无肿胀，触摸无硬结。由表3可知，剖杀后取股四头肌，对注射部位肌肉组织的刺激性反应分级。注射灭菌生理盐水的家兔肌肉组织与正常肌肉组织相同；注射长效土霉素2 d后，注射部位出现充血、红肿等刺激性反应症状；随着时间延长和给药剂量增加，刺激性增强，注射长效土霉素7 d后家兔股四头肌出现红肿、发紫、坏死、光泽消失现象，15 d后肌肉组织的坏死范围扩大。

表3 长效土霉素注射液家兔股四头肌刺激试验结果

“+”为有刺激性，数量越多刺激性越大；“-”为无刺激性。

3 讨论与结论

由于长效土霉素注射液的临床用法是肌肉注射给药，而安全性评价的指标又是以剂型为依据进行选择的。因此，选择了急性毒性试验和局部刺激性试验作为安全性评价指标。根据参考土霉素过量使用对肝脏、肾脏所造成的毒副作用的资料[6]，小白鼠会出现食欲减退、精神沉郁和运动失调；肝脏肿大，呈黄褐色，有出血点，易碎有油腻感；肾脏肿大，有出血点，易碎；部分小白鼠心脏稍有肿大，产生心包积液等症状。刘伟[7]等试验研究表明，给小鼠以465.2 mg/kg剂量注射长效土霉素注射液时，小鼠出现精神沉郁、被毛粗糙、嗜睡等症状，对小鼠进行剖检，发现小鼠肝脏肿大，呈黄褐色；肾脏肿大，有出血点；部分小鼠出现心脏稍有肿大，产生心包积液。在本试验中，给小白鼠注射新型长效土霉素注射液的剂量为462.6 mg/kg时，同样出现以上相类似的病发症状。且随着给药剂量的增大，症状越明显。因此，这表明致小鼠死亡的主要原因为土霉素使用过量。

根据毒理学分级标准，药物LD50在500～5000 mg/kg为低毒。季进英[8]等利用小白鼠检测一种长效土霉素注射液的急性毒性试验中，测得LD50为594.58 mg/kg，LD50的95%的可信限是594.58±2.22 mg/kg。根据毒理学分级标准其将长效土霉素注射液定为低毒。而本试验测得新型长效土霉素注射液的LD50为600.32 mg/kg，LD50的95%的可信区间为(600.32±2.44)mg/kg。同样在低毒范围内，该结果与资料试验所得结果一致。且该新型长效土霉素注射液的LD50偏高，说明相同致死率，该新型长效土霉素注射液需用更高的剂量，由此证明该新型长效土霉素注射液的处方工艺更优异，药品的急性毒性更小。

季进英[8]等利用家兔检测长效土霉素注射液的局部刺激性试验中，给药2、7、15 d后，眼观无肿胀，手摸注射部位无硬结，解剖发现2 d后肌肉组织出现充血、红肿现象；7 d后肌肉组织出现发紫、坏死；15 d后肌肉组织坏死范围扩大。根据家兔股四头肌刺激反应评价标准内容，由此判断长效土霉素注射液对家兔具有局部刺激性。在本次试验的给药剂量条件下，表明该药对肌肉组织有一定程度的刺激性，这与目前有关长效土霉素注射液具有局部刺激作用的报道一致[9-10]。

该新型长效土霉素注射液对小白鼠表现为低毒性，对家兔肌肉组织有一定程度的刺激性。