3株鸡传染性贫血病毒的全基因组序列分析

邓显文，张民秀，谢芝勋，张艳芳，谢丽基，谢志勤，刘加波，罗思思，曾婷婷

(广西壮族自治区兽医研究所, 广西兽医生物技术重点实验室, 南宁 530001)

鸡传染性贫血病(Chicken infection anemia, CIA)是由鸡传染性贫血病毒(Chicken infection anemia virus, CIAV)引起的鸡免疫抑制病，易感雏鸡感染该病毒主要表现为再生性贫血障碍、骨髓萎缩和胸腺淋巴组织萎缩等症状[1]。我国于1992年首次在鸡群中分离鉴定CIAV[2]，随后在黑龙江省、安徽省、广西省等地的鸡群均检测到CIAV的存在[3～5]。CIAV基因组全长约为2.3 kb，为单股负链DNA，含有3个开放阅读框(Open reading frames, ORFs)，分别是ORF1，ORF2和ORF3，依次编码Viral protein 3(VP3)、Viral protein 1(VP1) 和Viral protein 2(VP2)[6]。VP1蛋白是CIAV的核衣壳蛋白，并且是CIAV的唯一结构蛋白和主要免疫原蛋白，可刺激机体产生较高的中和抗体。VP2蛋白是CIAV的支架蛋白，并且是VP1蛋白的辅助蛋白，帮助VP1蛋白形成正确的构像，从而使VP1蛋白暴露出中和表位[7]。VP3蛋白是CIAV的非结构蛋白，又称为凋亡素，具有诱导鸡胸腺淋巴母细胞和原始造血细胞凋亡的作用，从而导致雏鸡出现再生性贫血障碍症[8]。

根据CIAV全基因组的遗传进化规律，将CIAV主要分为4个基因群，分别是Group A、Group B、Group C和Group D[9-10]。目前研究显示Group A在世界范围内广泛流行，是优势的基因群[11-13]。我国主要流行的基因群为Group A，鸡群中散发存在Group B 和Group D基因群[9]。解慧梅[14]在2012-2104年间对江苏省鸡群CIA进行了血清学调查，发现血清抗体阳性率平均达到31.9%。储鸿蒙[15]对安徽省CIA血清学调查显示，血清阳性率达63.6%。这些数据再一次证实了我国CIAV感染鸡群的广泛性。本研究分别于2018年1月、4月和8月在广西南宁市规模化鸡场采集到3份病鸡肝脏组织样品，运用CIAV的检测引物鉴定为CIAV阳性后，分段扩增CIAV的基因组，并进行测序后将分段扩增的目的片段进行拼接，获得3株CIAV的全基因组，对这3株CIAV的基因组进行序列分析，以期获得广西南宁市CIAV流行毒株的分子变异趋势，为进一步丰富CIAV的分子流行病学提供依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源及CIAV PCR鉴定 2018年1月、4月和8月份于广西南宁市规模化鸡场商品代肉鸡采集到3份肝脏组织。样品处理：磷酸缓冲溶液(PBS)按照(肝脏：PBS)1∶5稀释混成匀浆，将匀浆吸入到EP管中，反复冻融3次，3000 r/min离心20 min，取上清液并-70 ℃保存备用；运用参考文献[16]中的引物鉴定这3份病料均为CIAV阳性。

1.2 主要试剂 分子克隆所需试剂盒EasyPure Genomic DNA kit、DH5α感受态细胞和胶回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；pMD18-T、TaKaRa Ex Taq和DL2000 Maker购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

1.3 CIAV全基因扩增引物 扩增CIAV全基因引物如表1，引物由华大基因生物科技(深圳)有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.4 病料DNA的提取 3份阳性CIAV组织样品的DNA按照EasyPure Genomic DNA kit的操作说明书提取，提取好的DNA于-70 ℃保存备用。

1.5 CIAV全基因的扩增及序列分析 将提取好的DNA参照TaKaRa Ex Taq操作说明进行CIAV全基因的扩增。PCR产物进行电泳纯化后按照常规操作进行基因克隆，挑取阳性克隆菌液送华大基因生物科技(深圳)有限公司测序。应用LaserGene7.1对获得的序列进行拼接、拼接完成后运用LaserGene7.1和MEGA 4.0 软件对CIAV全基因序列的核苷酸、VP1、VP2和VP3蛋白氨基酸序列进行分析，并构建CIAV全基因、VP1、VP2和VP3基因的遗传进化树。从GenBank上获得28条CIAV全基因序列，其中包括13条国外参考毒株的全基因序列，15条国内参考毒株的全基因序列。

2 结 果

2.1 CIAV全基因扩增和序列测定结果 应用CIAV分段扩增引物对3份阳性CIAV的全基因进行分段扩增，扩增产物大小分别约为872、907和1254 bp，见图1。3株CIAV基因组经过基因测序鉴定后，运用LaserGene7.1对3段基因进行拼接后，3条全基因序列大小均为2298 bp，将3株CIAV进行命名，分别是GX1801、GX1804和GX1810，将序列上传至GenBank基因库，得到的相应序列号，分别是MK484614、MK484615和MK484616。

M: 100bp ladder; 1: 阴性对照; 2-4: 872bp片段；5-7: 907bp片段; 8-10: 1254bp片段M: 100bp ladder; 1: Negative control; 2-4: 872bp fragments；5-7: 907bp fragments; 8-10: 1254bp fragments

2.2 3株CIAV全基因序列同源性分析及遗传进化分析 GX1801、GX1804和GX1810全基因核苷酸序列之间的同源性为99.3%～99.7%，与28株参考毒株的核苷酸同源性为95.6%～99.8%；GX1801、GX1804和GX1810全基因序列与参考毒株的遗传进化分析表明(图2)，CIAV遗传进化树可分为4个基因群，分别是Group A、Group B、Group C和Group D，所参考的中国毒株分别分布在Group A、Group B和Group D群；本研究的3株CIAV与12株中国参考毒株同属于Group A，并与GD-104和GD-103的亲缘关系最近，同源性在99.3%～99.9%；该结果说明了国内的CIAV流行毒株主要以Group A基因群为主(图2)。根据遗传进化树的基因分群，将本研究3株CIAV全基因序列分别与属于Group A、Group B、Group C和Group D的参考毒株进行核苷酸进行同源性分析，结果显示与Group A的参考序列间的核苷酸同源性为96.5%～99.8%；与Group B的参考序列间的核苷酸同源性为97.7%～98.2%；与Group C的参考序列间的核苷酸同源性为96.2%～96.9%；与Group D的参考序列间的核苷酸同源性为95.6%～96.5%。

图2 CIAV全基因遗传进化树

2.3 运用VP1基因、VP2基因和VP3基因构建进化树的结果比较 比较基于VP1、VP2和VP3基因构建的遗传进化树，发现基于VP1构建的遗传进化树可分为Group A、Group B、Group C和Group D 4个基因群，并且与基于CIAV的全基因进化树分群相一致，而VP2和VP3的遗传进化树仅能分为Group A、Group B、Group C或Group A、Group D、Group C(图3)；以上数据说明CIAV的分群可依据VP1基因进行区分。

2.4 GX1801、GX1804和GX1810 VP1、VP2和VP3氨基酸序列分析 将本研究获得毒株和28株参考毒株的VP1蛋白的氨基酸序列进行比对，发现VP1蛋白的变异主要集中在第75、97、125、139、144、287、370、376、413和447位氨基酸位点；GX1801、GX1804和GX1810 VP1蛋白与28株参考毒株的氨基酸同源性为96.8%～100%，其中与GD-103 和GD-104的氨基酸同源性为99.8%～100%；分析GX1801、GX1804和GX1810 VP1蛋白高变区(139aa～151aa)发现，3个毒株在该区域没有出现氨基酸位点的增加和缺失，并且具有高度保守的特性；分析VP1蛋白上与毒力相关的氨基酸位点(第75、89、125、141、144、394位氨基酸位点)，发现GX1801、GX1804和GX1810与国外强毒株Cuxhaven-1在第75、89、141、394位氨基酸位点上保持一致，与弱毒株C369仅在第394位氨基酸存在差异；与日本强毒株C368、国内强毒株GD-103和GD-104株在第75、89、125、141、144、394位氨基酸位点全部一致，推测GX1801、GX1804和GX1810与日本强毒株C368、国内强毒株GD-103和GD-104株可能具有相似的致病性(表2)。

图3 基于VP1、VP2和VP3基因构建的遗传进化树

本研究中VP2蛋白氨基酸序列比对结果显示VP2蛋白上氨基酸位点的变异较少，说明VP2蛋白氨基酸序列高度保守，GX1801、GX1804和GX1810 VP2蛋白与28株参考毒株的氨基酸同源性为98.6%～100%；其中与GD-103 和GD-104的氨基酸同源性为99.5%～100%；GX1801、GX1804和GX1810 VP2蛋白上与磷酸酶活性相关的基序(I94CNCGQFRKH103)均未发生变异。比较所有VP3蛋白的氨基酸序列，结果发现VP3蛋白的氨基酸序列高度保守，未见有明显的变异；GX1801、GX1804和GX1810 VP3蛋白与28株参考毒株的氨基酸同源性为96.7%～100%；其中与GD-103 和GD-104的氨基酸同源性均为100%；分析GX1801、GX1804和GX1810 VP3蛋白与诱导细胞凋亡相关的重要区域(VP3蛋白N端结构域的第1-69位氨基酸)，发现这个区域高度保守。

表2 GX1801、GX1804、GX1810和Cuxhaven-1、C368、C369、GD-103、GD-104间的氨基酸位点变化

3 讨 论

蒋玲艳[5]于2002-2004年间对广西鸡群的CIAV的感染情况进行了流行病学调查，并证明CIAV在广西鸡群中普遍存在。邓显文等[17]于2006年对一株广西CIAV分离株进行遗传进化分析，发现该分离株与天津株TJBD40亲缘关系较近。近年来，未见有关于广西CIAV的流行情况的报道，本试验从临床组织样品中扩增并获得3株广西南宁CIAV的全基因序列，为广西CIAV的分子流行病学调查提供了重要材料。

本研究参考Eltahir等[9]对CIAV的分群，将CIAV遗传进化树分为4个基因群(Group A、Group B、Group C和Group D)，国内所参考的15株中国毒株分别分布在Group A、Group B和Group D群，与Eltahir Y M的研究相一致，本研究的GX1801、GX1804和GX1810毒株与12株中国参考毒株同属于Group A，再次证实了国内流行毒株主要以Group A群为主，并且GX1801、GX1804和GX1810毒株与国内毒株GD-103、GD-104的亲缘关系较近，其与GD-103、GD-104具有较高的氨基酸同源性，因此,推测GX1801、GX1804和GX1810毒株可能与GD-103、GD-104来源于同一毒株。本研究比较了基于CIAV全基因、VP1基因、VP2基因和VP3基因构建的进化树，发现CIAV全基因和VP1基因所构建的进化树相一致，而基于VP2基因和VP3基因构建的进化树不能够更细致的分群，因此基于VP1基因对CIAV进行分群给CIAV在基因群上的划分上带来一定的指导意义。

CIAV的致病性和在细胞上的增殖、复制与VP1蛋白的氨基酸位点关系密切。Renshaw 等[18]发现VP1上第139和第144位氨基酸位点均突变为谷氨酰胺(Q)时，会降低病毒在MACC-MSB1细胞上的增殖和传播效率。GX1801、GX1804和GX1810 VP1蛋白上第139和144的氨基酸位点分别为赖氨酸(K)和谷氨酸(E)，而与之比较的C368和C369株均能在MACC-MSB1细胞上增殖并具有较高的病毒效价[19]，因此，推测GX1801、GX1804和GX1810可能在MACC-MSB1细胞上具有很好的适应性。Todd等[20]对Cuxhaven-1株VP1蛋白位点第75、89、125、141、144都进行了突变，但仍然保留394位氨基酸为谷氨酰胺(Q)，发现该Cuxhaven-1突变株毒力减弱，并且不能引起贫血、骨髓和胸腺萎缩。本研究中参考的C368和C369株已经经过Yamaguchi等[19]的鉴定，分别是具有高致病性强毒株和低致病性的弱毒株，而国内毒株GD-103和GD-104毒株也已经经过蔺文成等[21]鉴定为强毒株，GX1801、GX1804和GX1810 VP1蛋白在毒力相关位点(第75、89、125、141、144和394位)上均与C368、GD-103和GD-104在同位点上保持一致，因此，推测本研究中的GX1801、GX1804和GX1810株可能具有高致病性，但需要进一步的人工感染试验才能确定。

CIAV 的VP2蛋白具有双重特异性磷酸酶活性，与磷酸酶活性相关的基序是位于VP2蛋白上第94～103位氨基酸(I94CNCGQFRKH103)，基序内的第95位和第97位氨基酸的突变会减弱病毒在MDCC-MSB1细胞上的复制能力和减少细胞病变[22]。本研究中GX1801、GX1804和GX1810 VP2蛋白上的I94CNCGQFRKH103高度保守，这是否能够导致MDCC-MSB1细胞上产生明显的细胞病变还需要进一步研究。Astrid等[23]研究发现，VP3蛋白与诱导肿瘤细胞凋亡相关的重要区域是位于N端结构域的第1～69位的氨基酸位点，该区域的缺失不能诱导肿瘤细胞的凋亡。本研究中GX1801、GX1804和GX1810 VP3蛋白 N端结构域的第1～69位氨基酸均高度保守，结合VP1毒力相关位点的分析，推测GX1801、GX1804和GX1810在感染鸡体后可能能够引起鸡类淋巴细胞和骨髓细胞的凋亡。