苹果提取物对花生蛋白水解物水包油乳状液氧化稳定性的影响

李佳婷，王敏

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100）

乳状液通常由一种液体以液滴的形式均匀的分散在另一种液体中，具有热力学稳定性，容易受到乳脂、沉淀、絮凝或凝聚等机制的影响，在储存过程中发生破乳，导致相分离现象的发生[1]。此外，由于乳状液中具有较大面积的油水界面，在贮藏的过程中会产生油脂氧化等问题。分散的脂质相和含有水溶性促氧化剂的水相之间较大的界面面积，增加了它们对氧化的敏感性，并且由于氧分子、金属离子等促氧化剂的存在会进一步降低体系的氧化稳定性[2]。而对抗油脂氧化最好的方式就是在乳状液中加入抗氧化剂以抑制氧化反应。现阶段，我国食品工业上主要是采用人工合成的抗氧化剂来提高乳化型食品的稳定性，虽然人工合成的抗氧化剂较为高效，但此类抗氧化剂对人体存在着潜在的危害，不利于人体的健康。因此，寻求健康、安全、绿色的天然抗氧化剂应用到食品工业中，成为当下研究的热点。

近年来，蛋白质水解物作为天然抗氧化剂同时还具有乳化效果而受到学术界的广泛关注。蛋白质经过酶解后导致肽键的断裂，自由氨基和羧基的浓度增加，从而能够增加蛋白质的溶解度[3]。已有研究表明对蛋白进行重度水解能够产生较多的游离氨基酸和小分子的多肽，使得蛋白质具有较强的抗氧化活性，但此时蛋白质已经丧失了原有的乳化特性[4]。然而，蛋白质在适度水解的情况下，二级和三级结构的部分展开和一级结构发生最小离解。此时，蛋白质水解物能够将乳状液乳化成小分子的液滴，减小乳化液滴的粒径，还能够通过终止自由基链式反应、螯合金属离子对抗油脂的氧化[5]。虽然，适度水解的蛋白质乳化性增强，但抗氧化活性却远不如重度水解后的蛋白质。多酚类化合物（如单宁酸、绿原酸、植物提取物等）能够通过共价键或非共价键与蛋白质形成复合物，改善蛋白的功能特性。苹果提取物是一种从苹果中提取出来的生物活性物质，含有原花青素、酚酸及黄酮类物质等。苹果提取物具有良好的保健效果，如预防高血压、抗氧化、防衰老、抗过敏、促进排毒等。苹果提取物具有较强的自由基清除能力和抗氧化能力，能够抑制脂质氧化，延长食品的储藏期。这类植物提取物的抗氧化活性主要与酚类化合物的存在有关，如肌酸和肌醇，它们是其主要的抗氧化成分。苹果提取物与多肽能够通过多酚中的芳香环和肽中的脯氨酸残基形成可溶性聚集体，提高其抗氧化活性[6]。因此，本试验以花生蛋白水解物（peanut protein hydrolysate，PPH）为主要研究对象，研究了苹果提取物（apple extract，AE）对花生蛋白水解物制备乳状液氧化稳定性的影响，为制备品质稳定的乳状液类型产品提供试验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花生蛋白粉：宜城天鑫油脂有限公司；大豆油：益海嘉里食品有限公司；十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfonate，SDS）：Sigma公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠：天津市巴斯夫化工有限公司；硫代巴比妥酸、三氯乙酸、过硫酸钾：美国Fisher公司。

1.2 仪器与设备

JB-2恒温磁力搅拌器：上海雷磁新径仪器有限公司；TU-1800紫外可见光分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；Ultra-Turrax T18高速分散器：德国IKA公司；AH-basic高压均质机：上海ATS公司。

1.3 试验方法

1.3.1 花生蛋白水解物的制备

称取一定量的花生蛋白将其配制成底物浓度为4%的溶液，经90℃预热5min用碱性蛋白酶分别水解1 h，酶与底物之比为2∶100（质量比），保持pH值不变。水解完成后，置于90℃水浴中加热5 min灭活，用1mol/LHCl将pH值调成中性后在4500g下离心15min后冻干备用。

1.3.2 乳状液的制备

将10 wt%的大豆油与90 wt%的PPH（质量分数4%）用高速均质机在13 500 r/min下乳化2 min后添加不同浓度AE（0、50、100和150 μg/mL，终浓度）混匀，在40 MPa下高压均质两次。加入NaN3（0.02%）抑制微生物。

1.3.3 絮凝指数和凝结指数的测定

絮凝指数（flocculation index，FI）和凝结指数（coagulation index，CI）的测定参照 Castellani等[7]的方法，计算方式如下：

式中：d4，3-water为乳状液分散在超纯水中，μm；d4，3-SDS为乳状液分散在 1%SDS 中，μm；d4，3-24h和 d4，3-0h分别为乳状液放置0 h和24 h的粒径，μm。

1.3.4 荧光光谱分析

取乳状液100 μL加入到5 mL磷酸盐缓冲溶液稀释（pH 7.0，0.01 mol/L）中。激发波长分别为283 nm，激发和发射狭缝宽度设置为10 nm，以240 nm/min的速率收集数据。

1.3.5 过氧化值（peroxide value，POV）的测定

POV测定参考硫代硫酸钠滴定法[8]。0.5 mL样品加入到10 mL乙酸/氯仿溶液（3∶2，体积比）震荡混匀后加0.5 mL饱和碘化钾溶液，混合后暗反应3 min，用超纯水终止反应。加入0.5 mL 0.5%淀粉溶液，用2 mmol/L Na2S2O3滴定至蓝色消失。

式中：A和B分别为样品和空白所消耗的Na2S2O3的体积，mL；C 为 Na2S2O3的浓度，mol/L；m 为样品的质量，g。

1.3.6 硫代巴比妥酸值的测定

根据Mei等[9]的方法并稍作改动。硫代巴比妥酸溶液的配制：将0.375 g硫代巴比妥酸、15 g的三氯乙酸，12 mol/L的盐酸1.76 mL和82.9 mL水混匀，再加入3 mL 2%的丁基羟基茴香醚（butyl hydroxyani sole,BHA）溶液。将1 mL样品与4 mL上述溶液以及1 mL水进行混合，沸水加热15 min，冷却25℃后，过0.45 μm滤膜，滤液在532 nm测吸光值，确定样品中丙二醛的含量。

1.3.7 PPH在乳状液中分布

乳状液在15 000 g下离心45 min，吸取下层乳清液15 000 g离心30 min后过0.22 μm滤膜。所得滤液稀释后用双缩脲法测蛋白含量，计算分配系数：

式中：PC 为分配系数；VW为水的体积，mL；Vl为油的体积，mL；Wt为总的蛋白含量，mg/mL；WW为水相中的蛋白含量，mg/mL。计算当中油的密度（g/mL）为0.922。

水相中蛋白占总的蛋白的比例计算公式为：

水相中PPH/%=（WW/Wt）×100。

1.4 统计分析

每个试验重复3次，结果表示为平均值±标准差。数据统计分析采用Statistix 8.1（分析软件，St Paul，MN）软件包中Linear Models程序进行，差异显著性（P＜0.05）分析使用Tukey HSD程序，采用Sigmaplot 11.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 絮凝指数和凝结指数的测定

通过粒径大小评估乳状液在储存期间是否存在絮凝和聚结的最常用方法之一。絮凝状态可能受到不同因素的影响，如界面吸附蛋白质、蛋白质/油比率、酸碱度、温度和离子强度。不同浓度AE对PPH稳定乳状液的絮凝指数（FI）和凝结指数（CI）的影响见表1。

未添加AE的乳状液，FI和CI分别为32.85%和99.95%。与对照组相比，随着AE用量的增加，FI和CI显著降低（P＜0.05），这表明AE的加入显著提高了乳状液的稳定性。在乳状液中，加入100 μg/mL AE的乳状液比其他添加量都具有更高的稳定性。乳状液的稳定性通常由静电和空间稳定性控制，通过油水界面上的蛋白质含量。静电稳定主要是由于液滴表面存在电荷，而空间稳定则是由于液滴表面的聚合物屏障的附着而产生的，而增加空间稳定性有助于减缓絮凝和聚结[10]。研究结果表明，AE的加入可能会在界面周围形成界面膜，从而导致更高的空间稳定性。因此，与单独应用PPH制备的乳状液相比，AE的加入可以在很大程度上抑制PPH在油滴表面聚集的发生。但是，当AE的添加浓度为150 μg/mL时，FI和CI增大，乳状液的絮凝和凝结稳定性都出现了不同程度的下降、稳定性降低。这可以解释为蛋白水解物的结构比较松散，并会与AE在界面上形成竞争吸附竞争吸附破坏了蛋白与多酚化合物的相互作用。

表1 不同浓度AE对PPH制备乳状液的FI和CI的影响Table 1 Effect of different concentrations of AE on FI and CI of PPH emulsion

2.2 荧光光谱分析

乳状液贮藏后会逐渐导致氨基酸发生氧化降解导致色氨酸荧光强度减弱，进而能够反应出蛋白质的氧化情况。乳状液样品在283 nm处激发，并在340 nm～360 nm具有最大峰值。不同浓度AE对PPH制备乳状液色氨酸荧光发射光谱的影响见图1。

图1 不同浓度AE对PPH制备乳状液色氨酸荧光发射光谱的影响Fig.1 The effect of different concentrations of AE on the fluorescence emission spectrum of tryptophan from PPH emulsion

添加不同浓度的AE都导致荧光强度降低，浓度越高荧光强度越弱。这可能是多酚类化合物能够与色氨酸发生反应，致使荧光强度降低。由于金属离子的存在，可使色氨酸分解为自由基并于氧接触发生氧化，从而导致脂质氧化。可见脂质氧化的越剧烈，色氨酸被分解的越多，荧光强度越弱。因此，过氧化物和丙二醛含量的变化趋势与色氨酸荧光强度呈现负相关的变化趋势。

2.3 POV和硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactant，TBARS）的变化趋势

不同浓度AE对PPH制备乳状液贮藏期的POV含量的影响见图2，不同浓度AE对PPH制备乳状液贮藏期的TBARS含量的影响见图3。

图2 不同浓度AE对PPH制备乳状液贮藏期的POV含量的影响Fig.2 Effect of different concentrations of AE on POV content in emulsion prepared by PPH during storage

图3 不同浓度AE对PPH制备乳状液贮藏期的TBARS含量的影响Fig.3 Effect of different concentrations of AE on TBARS content in emulsion prepared by PPH during storage

通过测定贮藏10 d乳状液的POV和TBARS，评价了AE对PPH稳定乳状液的脂质氧化的影响。众所周知，油脂中富含多种多不饱和脂肪酸，对氧和温度特别敏感。如图2所示，所有乳状液的POV值在储存期间都显著增加，增加的速度取决于AE的浓度。单用PPH制备的乳状液在整个贮藏过程中的POV值最高，这说明尽管限制性水解的花生蛋白比完整的花生蛋白具有更强的还原能力和自由基清除活性，但PPH稳定的乳状液仍易发生氧化。但AE加入到乳状液中后，比单独添加PPH植被的乳状液更能有效地抑制脂质氧化。此外，AE附着在如花特地的表面可以诱导更多的羟基，增加PPH在水相中的供氢能力，从而防止乳状液发生氧化。如图3所示，TBARS的结果遵循POV相似的变化趋势。在未含有AE的乳状液样品中，TBARS在10 d贮藏期间呈现显著增加的变化趋势。含有AE的乳状液，TBARS都低于未添加AE的乳状液。随着AE含量的增加，乳状液的TBARS值有更大程度的降低。可见，AE能够起到抑制油脂氧化的作用。总之，AE能够显著降低乳状液初级和次级产物的生成。并在界面膜上的AE和PPH发生协同作用，提供了改进的物理屏障，使其具有更高的抗氧化活性，增强了乳状液在储存期间的氧化稳定性[11]。

2.4 PPH在乳状液中的分布

蛋白质水解物在界面与水相中的具体位置或分配情况被认为是促进乳状液稳定性和抑制乳状液体系中脂质氧化速率的重要因素。不同浓度AE对蛋白质在乳状液中分布的影响见表2。

表2 不同浓度AE对蛋白质在乳状液中分布的影响Table 2 Effect of diffent concentrations of AE on the distribution of protein in emulsion

如表2所示，对于仅用PPH制备的乳状液，大部分PPH（约88.7%）分布在水相中，只有11.3%存在于界面层。此外，随着AE用量的增加，乳状液的分配系数呈现先增高后降低的变化趋势。AE的含量在100 μg/mL时乳状液分配系数最大，这是因为此时AE与PPH能够形成协同效应，增加乳状液界面上PPH的含量。PPH和AE在界面上的相互作用能够在油滴表面形成物理屏障，防止自由基的的渗入，起到稳定乳状液的作用。但是当AE的含量过高时，AE与PPH以竞争的方式将PPH从界面上解吸下来，使界面上的PPH含量降低，分配系数减小。但被解析下来的PPH依然可以在水相中清除自由基、螯合金属离子，发挥其对抗脂质氧化的作用[12]。说明在界面和水相中具有抗氧化活性的蛋白水解物可在乳状液储存期间延缓脂质氧化[13]。

3 结论

蛋白质与多酚化合物能够形成共价结合，并且内部的疏水基团和极性基团会暴露在表面，有助于分子间的相互作用，提高乳状液的稳定性。还能增加PPH在界面上的吸附量，有效的降低PPH制备的乳状液在贮藏期间的过氧化物和丙二醛的生成量。界面膜上的AE和PPH协同作用提供了改进的物理屏障，并且在水相中具有更高的抗氧化活性，促进乳状液在储存期间的氧化稳定性。添加AE浓度为100 μg/mL时，乳状液在储藏期间最为稳定，但是AE的添加量超过100 μg/mL会与PPH形成竞争吸附，影响PPH在界面上的分布，导致稳定性下降。