葡聚糖凝胶柱层析富集黑果枸杞总花色苷工艺及其抗氧化性研究

（江苏食品药品职业技术学院，江苏淮安223003）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）为茄科枸杞属多年生灌木野生植物，富含多种维生素、矿物质和花色苷，具有高度药食两用价值[1-2]。其中花色苷为花青素与不同单糖以糖苷键相连形成的化合物，有研究发现，其具有抗氧化、抗动脉粥样硬化、调节血脂及增强机体免疫等功效[3-4]，因而前人在其分离提取研究方面作出大量工作。由于光照、温度、pH值等理化因素均会影响其结构的稳定性，郑覃等采用超声提取黑果枸杞花色苷，极大缩短提取时间，增大提取效率[5]；同时，赵文娟等先后利用不同型号树脂对提取物进一步纯化，使得产物总花色苷含量明显提高[6-7]，但一般树脂精制取得的产物仍含有较多糖类、蛋白质等杂质[8]，因此对其提取物的纯化再研究，仍具有重大意义。

凝胶柱层析作为经典的分离纯化技术，具有选择性高、干扰因素少、可重复循环利用等特点，被广泛用于化工、制药、生物、环境等领域[9-11]。本研究利用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶分离特性，探讨富集黑果枸杞总花色苷的最佳工艺条件，从而为黑果枸杞花色苷的后续开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑果枸杞干果：宁夏杞爱原生黑果枸杞股份有限公司；AB-8大孔树脂：天津市西金纳环保材料科技有限公司；Sephadex LH-20填料：美国GE公司；无水乙醇、甲醇、氯化钾、醋酸钠、醋酸、盐酸、磷酸、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸：分析纯，国药集团上海化学试剂有限公司；锦葵色素-3-葡萄糖苷：天津一方科技有限公司；DPPH试剂：上海化成工业发展有限公司；试验用水为二次纯化水。

1.2 仪器与设备

AE224型电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；雷磁PHS-3C型pH计：上海精密科学仪器有限公司；RE-52型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；XO-SM 200型超声微波协同反应器：南京先欧仪器制造有限公司；TU-1900型紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；FD-1C-80型冷冻干燥机：北京博医康试验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 总花色苷粗提物制备

准确称取2.0 g黑果枸杞干粉置于圆底烧瓶内，加入50 mL，1%盐酸酸化的80%乙醇溶液后，避光于50℃超声提取（超声频率：40 KHz）1 h，离心（转速：4 000 r/min）收集上清液后，旋转蒸发乙醇，冷冻干燥，即得粗提物[5]。

1.3.2 树脂纯化物制备

依照文献所述树脂纯化条件[7]，采用AB-8大孔树脂纯化提取物中花色苷，所得产物即树脂纯化物。

1.3.3 凝胶柱预处理

葡聚糖凝胶湿法填装至层析柱（规格：15 mm×50 cm）后，采用2倍～3倍柱体积的无水乙醇平衡。每次上样前，经无水乙醇平衡后，进行上样吸附与洗脱[11]。

1.3.4 总花色苷含量测定

样品中总花色苷含量以锦葵色素-3-葡萄糖苷表示，采用pH示差法测定，具体如下：准确称取一定量粗提物溶于酸性乙醇后定容于100 mL容量瓶，准确移取一定体积分别使用pH 1.0和pH 4.5的缓冲溶液稀释10倍后，摇匀置于恒温水浴锅中30 min，分别测得在波长530 nm和700 nm处吸光度，另作空白试验，按照下式计算样品中总花色苷含量，平行测定6次[12]。

式中：W为样品总花色苷含量，mg/g；M为锦葵色素-3-葡萄糖苷摩尔质量，493 200 mg/mol；DF稀释因子；V为提取液体积，mL；ε为摩尔吸光系数，29 600 L/（mol·cm）；l为光程宽度，cm；m 为粗提物质量，g。

1.3.5 不同吸附条件影响

根据预试验结果，分别考察上样液浓度、pH值和上样流速对总花色苷吸附率的影响，具体如下：1）以50 mL无水乙醇为溶剂，将粗提物配制成pH值为3.0，浓度分别为 10、20、30、40、50 mg/L 的上样液，以1.0 mL/min流速上样；2）将粗提物配制成浓度为30 mg/L，pH 值分别为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 的上样液，以1.0 mL/min流速上样；3）将粗提物配制成总花色苷浓度为30 mg/L、pH值为3.0的上样液，分别以0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min流速上样，凝胶对粗提物中总花色苷的吸附率Q，照下式计算：

式中：m0为提取物总花色苷质量，mg；me为吸附后流出液中总花色苷质量，mg。

1.3.6 不同洗脱条件影响

根据预试验结果，考察上样结束后，洗脱液浓度、pH值和洗脱流速对产物中总花色苷解吸率影响，具体如下：1）分别以体积 150 mL，50%、60%、70%、80%、90%的pH值为3.0乙醇溶液为洗脱液，在1.0 mL/min流速洗脱；2） 分别以 pH 值为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 的80%乙醇溶液为洗脱液，在1.0 mL/min流速洗脱；3）以pH值为3.0的80%乙醇溶液为洗脱液，分别在0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min 流速下洗脱，每 5 mL 洗脱液为1管，测定洗脱液中总花色苷的浓度，并照下式计算解吸率。

式中：D为洗脱产物中总花色苷的解吸率，%；m0为提取液总花色苷质量，mg；md为洗脱液总花色苷质量，mg；me为吸附后流出液中总花色苷质量，mg。

1.3.7 动态吸附条件考察

在单因素试验基础上，采用三因素三水平的正交试验，以凝胶对样品总花色苷的吸附率为衡量指标，考察上样液浓度、上样液pH值和上样流速对总花色苷吸附效果的影响，确定最佳吸附条件，具体因素水平见表1所示。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Table of the factorial experiment

1.3.8 动态洗脱条件考察

在单因素试验基础上，采用三因素三水平的正交试验，以产物中总花色苷解吸率为衡量指标，釆用不同浓度的乙醇为洗脱液，考察洗脱液浓度（A）、洗脱液pH值（B）和洗脱流速（C）对总花色苷洗脱效果影响，确定最佳洗脱条件，具体因素水平见表2所示。

表2 正交试验因素水平表Table 2 Table of the factorial experiment

1.3.9 抗氧化性研究

1.3.9.1 DPPH自由基清除率检测

准确移取2 mL样品溶液至试管内，另加入2 mL DPPH乙醇溶液（0.2 mol/L)，摇匀后，避光放置30 min，以无水乙醇作空白对照，测得517 nm波长处吸光度，平行测定3次，照下式测得DPPH自由基清除率[13]。

式中：w为DPPH自由基清除率，%；A1为样品与DPPH自由基混合液吸光度；A2为样品与无水乙醇混合液吸光度；A0为DPPH自由基与无水乙醇混合液吸光度。

1.3.9.2 羟自由基清除率检测

准确移取2 mL样品溶液至试管内，另加入2 mL硫酸亚铁（3 mmol/L)和2 mL水杨酸-乙醇溶液（3 mmol/L)摇匀，最后加入2 mL双氧水（5 mmol/L)混合均匀后，于37℃水浴避光放置30 min，以纯化水作空白对照，测得510 nm波长处吸光度，平行测定3次，照下式测得羟自由基清除率[13]。

式中：M为羟自由基清除率，%；A0为纯化水+硫酸亚铁+水杨酸-乙醇+双氧水溶液的吸光度；A1为样品+硫酸亚铁+水杨酸-乙醇+双氧水溶液的吸光度；A2为样品+硫酸亚铁+水杨酸-乙醇+纯化水的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 上样液浓度对凝胶吸附率影响

若上样液浓度过高，易使得凝胶吸附达到饱和，导致花色苷过早泄漏，造成吸附率下降。而上样液浓度过低，分离纯化耗时过长，影响试验效率，不同上样液浓度对吸附率的影响，见图1。

图1 上样液浓度对吸附率影响Fig.1 The influence of sample concentration on adsorption rate of gel column

从图1可知，葡聚糖凝胶对花色苷的吸附率随浓度的增大先升高后降低，当上样液浓度为30 mg/L时，吸附率达到最大值为88.7%，因此本研究选择25、30、35 mg/L上样液浓度作为正交试验因素考察水平。

2.1.2 上样液流速对凝胶吸附率影响

在动态吸附过程中，上样流速过快，会使得目标分离物与凝胶接触不充分，而过早泄漏，但流速过慢，吸附工艺耗时过长，且对后续凝胶再生造成困难，不同上样流速对吸附率的影响，见图2。

图2 上样液流速对吸附率影响Fig.2 The influence of sample solution flow rate on adsorption rate of gel column

从图2可知，随着上样流速增大，吸附率不断下降，因此综合考虑吸附效率与效果，本研究选择0.5、1.0、2.0 mL/min上样流速作为正交试验因素考察水平。

2.1.3 上样液pH值对总花色苷吸附率影响

由于花色苷在较低pH值环境下易形成黄烊盐，而在较高pH值条件下又易电离质子，均会减少在凝胶中吸附[14]，不同上样液pH值对吸附率的影响，见图3。

图3 上样液pH值对吸附率影响Fig.3 The influence of sample solution pH value on adsorption rate of gel column

从图3可知，随着上样液pH值的增大，凝胶对总花色苷的吸附率先升高后降低，当pH值为3.0时达到最大值，因此本研究选择上样液pH值3.0、3.5、4.0作为正交试验因素考察水平。

2.1.4 洗脱液浓度对总花色苷解吸率影响

吸附在凝胶上的花色苷回收，依赖洗脱液洗脱，不同浓度乙醇对总花色苷的洗脱效果，见图4。

图4 洗脱液浓度对花色苷解吸率影响Fig.4 The influence of elution concentration on recovery

从图4可知，随着洗脱液浓度的增大，解吸率逐渐增大，至80%开始降低。这可能因为采用较高浓度乙醇，有利于争夺凝胶中活性位点，但浓度过高，会降低对花色苷部分组分的洗脱能力[15]，综合考虑本研究选择75%、80%、85%乙醇浓度作为正交试验因素考察水平。

2.1.5 洗脱液流速对总花色苷解吸率影响

不同洗脱流速对花色苷的解吸率影响，见图5。

图5 洗脱液流速对花色苷解吸率影响Fig.5 The influence of elution flow rate on recovery

从图5可知，随着洗脱流速的增大，解吸率逐渐降低，这源于洗脱液不能充分接触凝胶，即直接流出，且洗脱液用量也会增大，而流速过低，又延长洗脱过程，因此本研究选择1.0、1.5、2.0 mL/min洗脱流速作为正交试验因素考察水平。

2.1.6 洗脱液pH值对总花色苷解吸率影响

由于洗脱液pH值影响花色苷的洗脱效果[15]，因而分别考察不同洗脱液pH值对花色苷解吸率的影响，结果见图6。

图6 洗脱液pH值对花色苷解吸率影响Fig.6 The influence of elution pH value on recovery

从图6可知，随着洗脱液pH值的增大，花色苷的解吸率缓慢升高，至pH值为3.0时开始急剧下降，因此本研究选择洗脱液pH值2.5、3.0、3.5作为正交试验因素考察水平。

2.2 动态吸附工艺确定

根据上述单因素试验结果可知，上样液浓度、pH值和流速对凝胶吸附花色苷的效果影响较大，考虑单因素试验结果并非最优值，因此采用以三者为变量的正交试验，确定最佳动态吸附条件，结果见表3，试验结果方差分析见表4。

从表3与表4结果可知，各因素对凝胶吸附粗提物中总花色苷的影响顺序为A＞C＞B，其中上样液浓度对吸附率影响极其显著（P＜0.01），上样流速对吸附率影响显著（P＜0.05），通过极差分析可知，最佳动态吸附工艺条件为A1B2C2，即25 mg/L的pH值为3.5样品溶液，以1.0 mL/min流速上样至Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱中，有利于花色苷以分子形式较好吸附在凝胶筛孔内。

表3 吸附工艺正交试验结果Table 3 Results of the orthogonal-test method of adsorption process

表4 吸附工艺结果方差分析Table 4 Analysis of variance for the adsorption process factors

2.3 动态洗脱工艺确定

根据单因素试验结果可知，洗脱液浓度、pH值和洗脱流速对凝胶中花色苷的洗脱效果影响较大，因此采用正交试验，确定最佳动态洗脱工艺，结果见表5，相应结果方差分析见表6。

从表5与表6结果可知，各因素对花色苷的解吸率影响影响顺序为C'＞A'＞B'，其中洗脱流速对解吸率影响极其显著（P＜0.01），通过极差分析得到，最佳洗脱工艺条件为A'3B'3C'1，因此选择采用85%的pH值为3.5乙醇溶液，以1.0 mL/min流速洗脱被凝胶吸附的总花色苷。

表5 洗脱工艺正交试验结果Table 5 Results of the orthogonal-test method of elution process

表6 洗脱工艺结果方差分析Table 6 Analysis of variance for the elution process factors

2.4 最佳分离纯化条件验证和结果比较

根据上述单因素与正交试验优选得到的Sephadex LH-20葡聚糖凝胶富集纯化黑色枸杞花色苷工艺条件为：质量浓度为25 mg/mL的pH值为3.5样品溶液以1.0 mL/min流速上样至凝胶柱后，采用pH值3.5的85%乙醇溶液，以1.0 mL/min流速洗脱，平行试验6次，测得对花色苷的吸附率与洗脱率分别为90.9%和85.3%，另外采用凝胶富集、树脂纯化及超声提取得到的产物中总花色苷的含量比较，见表7，凝胶柱层析富集后产物的总花色苷含量高于树脂纯化物。

表7 不同产物中总花色苷的含量（n=6）Table 7 The results of anthocyanins contents of different product（n=6）

2.5 总花色苷抗氧化性

2.5.1 DPPH自由基清除能力

不同产物对DPPH自由基的清除率结果见图7。

图7 不同产物对DPPH自由基的清除率Fig.7 The clearance rate of DPPH free radicals for different product

过量的DPPH自由基容易造成细胞组织损伤和生物大分子结构的变化，总花色苷可提供质子氢，还原自由基，形成稳定化合物。从图7可见，黑果枸杞总花色苷浓度在0.01mg/mL～0.05 mg/mL时，随着其质量浓度增加，对DPPH自由基清除率不断增强，当质量浓度为0.05 mg/mL时，提取物、树脂和凝胶纯化黑果枸杞总花色苷的清除率分别为77.4%、82.8%、85.2%，表明提取物、树脂与凝胶纯化后产物对DPPH自由基的清除能力依次增大，且DPPH自由基清除率与总花色苷浓度呈正相关，与相关文献所述一致[16-17]。

2.5.2 羟自由基清除能力

不同产物对羟自由基的清除率结果见图8。

图8 不同产物对羟自由基的清除率Fig.8 The clearance rate of hydroxyl radical for different product

向双氧水反应体系中加入总花色苷后，有色化合物生成量减少，可利用吸光度变化反映总花色苷抗氧化能力。从图8可知，黑果枸杞总花色苷浓度在0.01 mg/mL～0.05 mg/mL时，随着其质量浓度增加，对羟自由基清除率不断增强，当质量浓度为0.05 mg/mL时，提取物、树脂和凝胶后产物对羟自由基的清除率分别为88.4%、91.5%、94.2%，从而可知3种产物对羟自由基的清除能力依次为凝胶纯化＞树脂纯化＞提取物。

3 结论

本研究采用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱富集黑果枸杞粗提物中总花色苷，利用单因素与正交试验优化得到的最佳富集纯化工艺条件：质量浓度为25 mg/L的pH值为3.5样品溶液，以1.0 mL/min流速上样至凝胶柱后，采用85%的pH值为3.5乙醇溶液，以1.0 mL/min流速洗脱，对总花色苷的吸附率和解吸率分别为90.9%、85.3%，得到的富集产物含量明显高于树脂纯化物。该工艺操作简便、富集纯化效率较高，且产物对羟自由基和DPPH自由基清除作用较好，可为黑果枸杞花色苷的后续开发利用提供参考。