虫草素的N-丙烯酰化的修饰

金英今，张敬东，王思宏，*，李东浩

（1.延边大学分析测试中心，吉林延吉133002；2.延边大学理学院，吉林延吉133002）

冬虫夏草和蛹虫草，是我国特有的传统名贵中药材，具有重要的食用与药用价值。冬虫夏草和蛹虫草具有增强机体免疫力、降血压、抗氧化、抗疲劳等多种活性功能，有极高的药用价值，可作为药材与其它中药配伍，从而起到治疗疾病的效果[1-2]。虫草素（cordy－cepin）[3-5]为冬虫夏草和蛹虫草的活性成分之一[6]。1997年被美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准用于淋巴细胞白血病的临床试验[7]。1976年，Johns等发现虫草素进入生物体内后容易被腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）分解，为降低分解程度，临床上需与腺苷脱氨酶抑制剂配对使用，或者对它的化学结构进行修饰，化学结构修饰除了能够降低虫草素在生物体内的分解率，还可能赋予虫草素新的生物功效，比如作为前药而发挥作用，虫草素在ADA作用下快速脱氨基对其单独用于体内实验带来很大的局限性，也使其作为药物进行研发造成了一定的困难。虫草素进入动物体后，主要是分子结构中的伯氨基容易被快速氧化。因此，如果通过化学结构修饰的手段，将该伯氨基用酰胺键保护起来，就有可能阻止其快速氧化，从而起到减缓虫草素在体内的代谢速度的作用。以虫草素为先导化合物，对其化学结构修饰，设计并创造出新的衍生物，是虫草素开发利用最好的途径。所以未来虫草素在生物体内作用效率的研究重点将放在它的化学结构修饰方面上[8-9]。

aza-Michael反应是氨基与烯烃的共轭加成，被认为是100%原子效率。反应条件温和，收率较高。该反应被广泛关注和应用于药物和天然产物的制备中，aza-Michael反应是制备功能性烷氧基硅烷的有效途径之一。功能化磁性材料由于具有超顺磁性、良好的生物相容性和较高的结合能力，大规模的应用在生物医学样品制备中。

因此以虫草素为原料，丙烯酰氯为酰化剂，通过酰化反应，合成N-丙烯酰虫草素。并与含氨基物质发生aza-Michael反应见图1。

图1 N-丙烯酰虫草素合成的反应路线及aza-Michael反应Fig.1 Reaction route and aza-Michael reaction of N-acrylamide cordycepin

拟进行修饰的虫草素与磁性材料杂化[10]。本文的研究将促进虫草素的进一步研究和开发，对其他天然药物和功能材料的研究和开发具有方法学上的指导意义和借鉴作用。

1 试验部分

1.1 主要仪器与试剂

AV-300核磁共振仪、maXis高分辨飞行时间质谱仪：Bruker公司；MPMS-XL-7振动样品磁强计：美国Quantum Design公司；KH-50高压釜：上海裕英仪器有限公司；SZ-93自动双重蒸馏水器：上海亚荣生化仪器厂；柱层析硅胶（300目～400目）、GF254型薄层层析硅胶：青岛海洋化工有限公司。

钕铁强磁铁：宁波永磁磁性材料厂；虫草素、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、二甲基亚砜-d6（dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6）、甲 醇 -d4（methanol-d4，CD3OD-d4）、N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）、丙烯酰氯、茚三酮、三乙胺（分析纯）：上海阿拉丁试剂有限公司；四水合氯化亚铁、浓氨水、二氯甲烷、氯仿、石油醚（40℃～60℃）、甲醇、乙醇、无水硫酸镁（分析纯）：上海沪试实验室器材股份有限公司。

1.2 N-丙烯酰虫草素的合成

参考文献的方法进行丙烯酰化反应[11]。在磁搅拌和氮气保护下，将丙烯酰氯（5 μL，0.02 mmol）用二氯甲烷（2 mL）溶解后，冰水浴下，滴入用二氯甲烷（2 mL）溶解的虫草素（5 mg，0.02 mmol）和三乙胺（3 μL，0.02 mmol）中，搅拌 1 h 后，加入石油醚（2 mL），析出白色沉淀，过滤，滤液浓缩，加水，乙酸乙酯（2 mL）提取3次，合并，无水硫酸镁干燥，然后用硅胶柱（300目～400目硅胶）纯化，洗脱液为氯仿∶甲醇=20∶1（体积比），将所得洗脱液浓缩，得到白色薄片状产物，收率为96%。采用b型管测定熔点，化合物的熔点测定值未进行校正。虫草素熔点：229℃～230℃，N-丙烯酰虫草素熔点：126℃～127℃。比移值（Rf）0.76（氯仿 ∶甲醇=9∶1，体积比）。

1.3 N-[1-氧代丙烷-3-（3-（三乙氧基硅基）丙基）氨基]虫草素的合成

利用N-丙烯酰虫草素的aza-Michael反应进行合成。3-氨基丙基三乙氧基硅烷（4.0 mg，0.02 mmol），N-丙烯酰虫草素（6.0 mg，0.02 mmol），甲醇（7 mL），室温22℃反应2 d，产品为无色油状物（100%）。Rf 0.33，氯仿 ∶甲醇=9∶1（体积比）。

1.4 Fe3O4-NH2@N-丙烯酰虫草素的合成

Fe3O4-NH2的水热法合成。将四水合氯化亚铁（1.25 g）溶解于7.75 mL水中。在剧烈搅拌下，添加浓氨水（6.25 mL），将悬浮液在空气中连续搅拌10 min，使Fe（II）氧化。然后，加入2.5 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，将反应混合物放在体积为50 mL、温度为130℃的KH-50高压釜密封压力容器中，3 h，将反应混合物冷却至室温（22℃），Fe3O4-NH2反复用5次蒸馏水洗涤，除去水溶性杂质[12]。

利用aza-Michael反应的Fe3O4-NH2的表面修饰。取干燥的两颈瓶，加入DMF，称取干燥的Fe3O4-NH2粉末，得到Fe3O4-NH2的分散液，在分散液中加入N-丙烯酰虫草素，机械搅拌3 d，在钕铁强磁铁辅助下，用甲醇和水反复洗涤5次[10]。

1.5 抗菌活性测试

参照本课题组发表文献进行，采用屎肠球菌Enterococcus faecalis 3511测试抗菌活性[13]。

2 结果与讨论

虫草素分子结构中，芳伯氨基和糖分子上的羟基均可能和烷酰氯发生酚化反应。但显然芳伯胺基的氢比羟基氢活泼得多，当虫草素分子和烷酰氯发生酰化反应的时候，是芳伯胺基首先和烷酰氯发生反应生成目标产物。反应过程中必须严格控制反应物的量、试剂滴加的速度和反应温度，以防止副产物的大量产生。此外，应控制反应物中水分含量，以防止烷酰氯和反应体系中的水分反应生成大量的酸，否则会影响给反应物的纯化。丙烯酰氯因分子结构中含碳碳不饱和双键和氯原子基团，能发生多种类型的化学反应，进而衍生出较多种有机化合物[11]，故选择其为酰化试剂。

DMSO-d6作为溶剂虫草素的核磁共振氢谱数据，δ：8.33（1H，s，2-H），8.11（1H，s，8-H），7.25（2H，s，-NH2），5.835（1H，d，J=3.0 Hz，1`-H），5.625（1H，d，J=3.0 Hz，2`-H），5.13 （1H，m，4`-H），4.56 （1H，m，2`-OH），4.33（1H，m，5`-OH），3.65-3.95（1H，m，5`-Ha），3.51 （1H，m，5`-Hb），2.25-2.18 （1H，m，3`-Ha），1.92（1H，m，3`-Hb）。CD3OD-d4作为溶剂虫草素的核磁共振氢谱数据。CD3OD-d4作为溶剂虫草素的核磁共振氢谱数据，δ：8.42（1H，s，2-H），8.20（1H，s，8-H），5.945（1H，d，J=3.0 Hz，1`-H），4.70 （1H，quint，J=3.0 Hz，2`-H），4.54（1H，m，4`-H），3.925（1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Ha），3.675 （1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Hb），2.38（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Ha），2.06（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Hb），见图 2。

因为溶剂效应，虫草素的CD3OD-d4和DMSO-d6核磁共振谱图表现出差异。DMSO-d6作为溶剂虫草素展现了所有的氢的核磁共振吸收峰，而CD3OD-d4作为溶剂的虫草素中的氨基和羟基因为与氘代试剂中活泼氢都未出现核磁共振吸收峰，而谱图裂分精细，CD3OD-d4作为溶剂谱图的峰尽管失去活泼氢的信息，但是有良好的分辨度，因而N-丙烯酰虫草素选用CD3OD-d4作为溶剂测试核磁共振氢谱。

CD3OD-d4作为溶剂N-丙烯酰虫草素核磁共振氢谱数据，见图 2。核磁共振氢谱（CD3OD-d4，300 MHz），δ：8.42（1H，s，2-H），8.20（1H，s，8-H），6.15（1H，dd，J=3.0，6.0 Hz，3``-H），5.955（1H，d，J=3.0 Hz，1`-H），5.645（2H，dd，J=3.0，6.0 Hz，4``-H），4.70（1H，quint，J=3.0 Hz，2`-H），4.54（1H，m，4`-H），3.925（1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Ha），3.675（1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Hb），2.38（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Ha），2.06（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Hb）。核磁共振碳谱（CD3OD-d4，75 MHz），δ：177.4（C-2``），157.4（C-2），153.6（C-6），149.9（C-4），141.1（C-8），134.0（C-3``），127.7（C-4``），120.7（C-5），93.6（C-1`），82.6（C-4`），76.6（C-2`），64.2（C-5`），34.5（C-3`）。135度无畸变极化转移技术图谱（CD3OD，75 MHz），δ：153.61（CH，C-6），141.14（CH，C-8），134.0（CH，C-3``），127.7（CH2，C-4``），120.7（CH，C-5），93.6（CH，C-1`），82.6（CH，C-4`），76.6（CH，C-2`），64.2（CH2，C-5`），34.5（CH2，C-3`）。二维氢氢相关谱中 δ：6.15（3``-H），5.645（4``-H）；3.925（5`-Ha），3.675（5`-Hb）；2.38（3`-Ha），2.06（3`-Hb）是相关的。高分辨质谱，m/z：304.1122[M-H]-，计算值：305.112 4。

图2 虫草素和N-丙烯酰虫草素核磁共振谱对比图Fig.2 Nuclear magnetic resonance spectra of cordycepin and N-acrylamide cordycepin

比较虫草素和N-丙烯酰虫草素的核磁共振氢谱图，观察新增或减少的质子峰的种类和数量与目标化合物N-丙烯酰虫草素的吻合程度。N-丙烯酰虫草素的核磁共振氢谱数据中新出现δ：6.15（3``-H），5.645（4``-H）峰，核磁共振碳谱中新出现177.4（C-2``），134.0（C-3``），127.7（C-4``）峰，135 度无畸变极化转移技术图谱中新出现 134.0（CH，C-3``），127.7（CH2，C-4``），二维氢氢相关谱中 δ：6.15（3``-H），5.645（4``-H）峰具有相关性，异核多量子相关谱图（HMQC）中δ：6.15（3``-H）对应 δ：134.0（C-3``），δ：5.645（4``-H）对应δ：127.7（C-4``），是丙烯酰中的烯键氢的相关性。因为氨基的亲核性大于羟基，丙烯酰反应保留了虫草素的糖原部分，丙烯酰反应选择性发生在虫草素中的氨基部分。综上几种核磁谱图和高分辨质谱数据，结合生成产物的Rf值、熔点等理化参数，也进一步印证了虫草素连接上丙烯酰键[6]。

3-氨基丙基三乙氧基硅烷与N-丙烯酰虫草素中烯烃发生了aza-Michael反应，核磁共振氢谱中（CD3OD-d4，300 MHz），δ：8.41 （1H，s，2-H），8.19（1H，s，8-H），5.945（1H，d，J=3.0 Hz，1`-H），4.705（1H，quint，J=3.0 Hz，2`-H），4.53（1H，m，4`-H），3.92（1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Ha），3.67（1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Hb），3.34 （m，2H，CH2），2.71（m，2H，CH2），2.64（m，2H，CH2），2.36（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Ha），2.065（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Hb），1.63（m，8H，4×CH2），0.65（m，9H，3×CH3）。核磁共振碳谱（CD3OD-d4，75 MHz），δ：173.7（C-2``），152.4（C-2），151.8（C-6），149.8（C-4），140.3（C-8），123.5（C-5），99.3（C-1`），82.4（C-4`），74.8（C-2`），63.8（C-5`），58.4（3×OCH2），52.4（-NHCH2），49.5（-NHCH2），35.2（CH2），34.5（C-3`），25.8（CH2），18.4（3×CH3），14.1（CH2）。高分辨质谱，m/z：527.256 9[M+H]+，计算值：526.257 1[14]。N-丙烯酰虫草素的核磁共振氢谱 δ：6.15（3``-H），5.645（4``-H）峰消失，新增加了 δ：3.34（CH2），2.71（CH2），2.64（CH2），1.63（4×CH2），0.65（3×CH3）峰，以及核磁共振碳谱中134.0（C-3``），127.7（C-4``） 峰消失，新出现 δ：58.4（3×OCH2），52.4（-NHCH2），49.5（-NHCH2），35.2（CH2），25.8（CH2），18.4（3×CH3），14.1（CH2），N-丙烯酰虫草素的核磁共振氢谱和核磁共振碳谱发生变化，对比N-丙烯酰虫草素的核磁共振氢谱和核磁共振碳谱、高分辨质谱、Rf值，表明3-氨基丙基三乙氧基硅烷与N-丙烯酰虫草素完成了反应，生成了N-[1-氧代丙烷-3-（3-（三乙氧基硅基）丙基）氨基]虫草素。借鉴这个模板反应，利用aza-Michael反应的优点，进行表面含有氨基的磁性材料的修饰，通过茚三酮比色法、x射线粉末衍射、磁滞回线对比追踪了杂化反应进程。

按《中国药典》方法配制茚三酮溶液（2 g茚三酮，溶于100 mL乙醇即得）[15]，Fe3O4-NH2中氨基的茚三酮反应中是紫色，发生了aza-Michael反应，反应完全后紫色消失。Fe3O4-NH2和Fe3O4-NH2@N-丙烯酰虫草素x射线粉末衍射图谱见图3。

图3 Fe3O4-NH2和Fe3O4-NH2@N-丙烯酰虫草素x射线粉末衍射图谱Fig.3 X-ray powder diffraction patterns of Fe3O4-NH2and Fe3O4-NH2@N-acrylamide cordycepin

由图3所示，N-丙烯酰虫草素和Fe3O4-NH2@N-丙烯酰虫草素衍射峰的变化。衍射峰的位置Theta 30°～60°有衍射峰，与磁铁矿（Joint Committee on Powder Diffraction Standards，JCPDS 89-4319） 的位置是一致的，Theta 15°～30°宽峰表明了颗粒的杂化中的有机化合物的存在。

杂化前Fe3O4-NH2磁饱和率为80.0 emu/g，杂化后Fe3O4-NH2@N-丙烯酰虫草素变为50.0 emu/g，杂化前后磁饱和率的差异显示虫草素被修饰了，见图4。

图4 Fe3O4-NH2和Fe3O4-NH2@N-丙烯酰虫草素磁滞回线Fig.4 Magnetic moments of Fe3O4-NH2and Fe3O4-NH2@N-acrylamide cordycepin

虫草素、N-丙烯酰虫草素、Fe3O4-NH2@N-丙烯酰虫草素的最小抑菌浓度（minimal inhibit concentration，MIC）分别为 16、1.6、3.2 μg/mL。虫草素、N-丙烯酰虫草素、Fe3O4-NH2@N-丙烯酰虫草素抗菌生理活性的差异，意味着虫草素修饰后氨基是稳定的[16]。

3 结论

用反应位点多的丙烯酰基对虫草素中的氨基进行了N-丙烯酰基修饰，并结构确认，新合成出的N-丙烯酰虫草素，能100%与3-氨基丙基三乙氧基硅烷发生aza-Michael反应，生成N-[1-氧代丙烷-3-（3-（三乙氧基硅基）丙基）氨基]虫草素。借鉴这个思路，用N-丙烯酰虫草素进行了水热法合成的Fe3O4-NH2的表面修饰。虫草素经化学结构修饰后，可以达到延缓虫草素体内代谢速度的目的。虫草素改变成丙烯酰后，其抗菌活性和虫草素相比，其对枯草杆菌的MIC降低了近10倍，是一个值得进一步深入研究和有潜在开发利用价值的新化合物，药物作用机制等问题还有待进一步实验的研究和确证。

本文将生物、有机合成、有机无机杂化以及药物化学理论应用于天然药物活性成分的研究开发中，全面提升天然药物活性成分的生产水平，大力降低其生产成本，并以天然活性成分为先导化合物、通过化学结构修饰的手段研究开发具有更高药理活性的新型药物，对其它天然药物的研究和开发具有方法学上的指导意义和借鉴作用。