糖基化终末产物对人牙龈成纤维细胞炎症因子分泌及P65表达的影响

柴 琳，杨艳玲，刘润泽，杨晓宇，方卓然，葛非凡，邓 超

(皖南医学院 口腔医学院，安徽 芜湖 241002)

糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)是一类多相化合物，来源于氨基酸中还原糖和游离氨基之间的自发反应，即经典的Maillard反应，AGEs也可以由多种其他反应产生，包括糖、脂类和氨基酸的氧化，以产生与蛋白质共价结合的活性醛[1]。如果组织和循环系统中积累了过多的AGEs，机体就会出现病理变化，AGEs与氧化应激和炎症有关，炎症最终会导致大多数慢性疾病，包括心血管疾病，糖尿病，慢性肾脏病(CKD)和神经退行性疾病等[2]，牙周炎症是最常见的一种口腔疾病，随着糖尿病患者体内AGEs的集聚，患者牙周组织周围炎症随之加剧，本实验探讨了AGEs对牙龈成纤维细胞的影响，通过检测TNF-α、IL-6的表达，明确AGEs可导致牙龈成纤维细胞的炎症分泌，并通过对NF-кB信号通路p65关键分子的检测，探讨NF-кB信号通路在其中可能发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、实验仪器 PBS(HyCIone；USA)；α-MEM培养基(Gibco；USA)；胎牛血清(四季青；杭州)；双抗(Gibco；USA)；Ⅰ型胶原酶(Solarbio；USA)；胰蛋白酶(Gibco；USA)；AGE-BSA(BioVision；USA)；TRIzol裂解液(Ambion；USA)；逆转录试剂盒(TIANGEN；北京)；RT-PCR试剂盒(TIANGEN；北京)；二氧化碳培养箱(Thermo；USA)；超净培养台(Thermo；USA)；倒置相差显微镜(OLYMPUS；Japan)。

1.2 实验方法

1.2.1 取材 牙龈组织取材于皖南医学院第一附属医院口腔颌面外科门诊因正畸拔除的患者。取材前征得患者及家属同意。要求患者无全身系统性疾病，牙龈组织健康。患者年龄14～20岁。

1.2.2 细胞培养 原代培养：酶消化结合组织块法培养牙龈成纤维细胞：将新鲜取出带有牙龈组织的牙齿投放在预冷的含有双抗和PBS比例为1∶100的PBS中，2 h内进行实验。在超净工作台中用含双抗的PBS溶液反复冲洗干净后转移到无菌培养皿中用手术刀轻轻刮取牙颈部的牙龈组织块。1000 r/min离心5 min。弃上清后，加入含3 mg/mL I型胶原酶1mL，37.5℃每隔5 min振荡，消化70 min，加入少量胎牛血清终止消化。离心后弃上清，加入2 mL α-MEM培养液(含10%胎牛血清)，将其置于二氧化碳培养箱(5%CO2，37℃恒温)中孵育，每隔一天换液。

传代培养：待细胞长至瓶底70%～80%时，PBS冲洗1～2遍，加入少量0.25%含EDTA的胰酶置于37℃二氧化碳恒温箱中消化5 min，终止消化后离心去上清，进行常规传代培养。

1.3 实验分组 牙龈成纤维细胞分为正常组和实验组于六孔板中培养。正常组用含有5%胎牛血清的2 mL α-MEM培养液培养，实验组分别向培养液中加入1、5、10和20 μL/mL的AGEs。

1.4 Real-time PCR检测炎症因子IL-6、TNF-α及P65的表达 将正常组和对照组的牙龈成纤维细胞用TRIzol裂解，提取RNA，经逆转录为cDNA。引物设计有上海生工生物有限公司设计合成(表1)。

表1 引物序列

GeneForward primerReverse primerIL-65'CACTGGTCTTTTGGAGTTTGAG3'5'GGACTTTTGTACTCATCTGCAC3'TNF-α5'AGCTGGTGGTGCCATCAGAGG3'5'TGGTAGGAGACGGCGATGCG3'P655'GGGATGAGATCTTCCTACTGTG3'5'GTGACGATCGTCTGTATCTGG3'β-actin5'GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG3'5'CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG3'

2 结果

2.1 人牙龈成纤维细胞的培养 用酶消化+组织块法培养的原代细胞与实验室既往实验培养的牙龈细胞形态一致，3 d左右有牙龈细胞贴壁，胞液丰满(图1)，待细胞长到90%进行传代，实验选用细胞状态良好的第三代细胞作为研究对象(图2)。

2.2 AGEs刺激下人牙龈成纤维细胞IL-6、TNF-α的表达情况 分别用含AGEs终浓度分别为1、5、10、20 μL/mL培养液培养人牙龈成纤维细胞，Real time PCR检测IL-6、TNF-α的mRNA表达情况，结果显示，AGEs各浓度组IL-6的mRNA表达较对照组均增加(P<0.05)，TNF-α的mRNA表达量在5～20 μL/mL浓度组也增加(P<0.05)。见表2、3。

2.3 AGEs刺激下人牙龈成纤维细胞中NF-κB信号通路关键分子P65表达情况 分别检测不同AGEs浓度组中NF-κB信号通路关键分子P65表达情况(表4)，Real time PCR结果显示在5、10、20 μL/mL浓度组，P65表达均上调(P<0.05)；而在1 μL/mL浓度组P65表达差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 原代培养的牙龈成纤维细胞

图2 第三代牙龈成纤维细胞

组别AGEs浓度/(μL/mL)IL-6表达情况对照组01.000±0.003 实验组12.235±0.111*55.400±0.226*105.411±0.161*207.239±0.127*F931.918P0.000

注：与对照组比较，*P<0.05。

组别AGEs浓度/(μL/mL)TNF-α表达情况对照组01.003±0.051 实验组11.202±0.120 55.434±0.233*107.660±0.200*207.454±0.190*F1081.368P0.000

注：与对照组比较，*P<0.05。

组别AGEs浓度/(μL/mL)P65表达情况对照组01.002±0.028 实验组11.176±0.060 52.464±0.131*103.128±0.157*204.955±0.152*F563.051P0.000

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

近年来有临床及基础对照研究表明，糖尿病和牙周炎互相影响[3-4]，在局部刺激因素相似的情况下，有糖尿病者的牙周病发生率及严重程度均大于无糖尿病者；而经过完善牙周治疗的患者，其血糖水平的控制要优于未进行牙周治疗组[5]。糖基化终末产物与其细胞受体作用的加强可导致牙龈成纤维细胞的凋亡[6]，糖基化终末产物是单核-巨噬细胞的趋化物质，有研究表明AGEs可激活糖尿病肾病的炎症途径[7]。

本实验中我们分别用不同浓度的AGEs(1、5、10、20 μL/mL)刺激人牙龈成纤维细胞，实验结果发现在不同浓度的AGEs刺激下人牙龈成纤维细胞中IL-6的表达水平均上升，在1 μL/mL组TNF-α的表达水平没有差异，但随着浓度的增加，TNF-α的表达水平也上调，实验结果表明糖基化终末产物刺激了人牙龈成纤维细胞炎症因子的分泌。本实验检测了NF-κB信号通路关键分子P65表达情况，NF-кB(nuciear factor-kappaB)是在1986年从B淋巴细胞核的提取物中检测到的一种核蛋白因子，存在于几乎所有的细胞液中。大量的研究表明NF-кB信号通路与炎症密切相关[8-10]，当TNF-α、IL-6、脂多糖等较强的诱导剂存在时，P65起到了转录激活的作用，NF-кB激活后，进入细胞核，进而促进相关炎症因子的转录。实验检测到在5、10、20 μL/mL浓度的AGEs刺激下，P65的表达水平上调，而在1 μL/mL组P65的表达没有改变，提示随着体内AGEs浓度的积累，NF-кB信号通路被激活，从而进一步加剧了炎症反应。

本研究基于人牙龈成纤维细胞，糖基化终末产物(AGEs)以及牙龈炎的研究背景，探索人牙龈成纤维细胞在AGEs刺激下炎症因子的分泌情况，并对其中可能的信号通路进行探讨，明确了AGEs刺激下人牙龈成纤维细胞释放大量炎症因子TNF-α和IL-6，从而激活了NF-кB信号通路，导致牙龈炎症的易感性增加，从而解释临床上糖尿病患者牙龈炎多发的原因。