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下调miR-27a表达对三阴乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

2020-04-07徐五琴黄建军李小宁

关键词:泛素细胞系培养基

程 龙,徐五琴,张 鹏,黄建军,李小宁

1. 皖南医学院弋矶山医院检验科,芜湖 241001;2. 皖南医学院弋矶山医院病理科,芜湖 241001

三阴乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)是指雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)和人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)表 达均为阴性的乳腺癌,其占所有乳腺癌的15%~25%,且具有特殊的生物学表达及临床病理特性[1]。与非三阴乳腺癌(non-triple-negative breast cancer,non-TNBC)相 比,TNBC具有较高的复发率及转移率,患者生存时间短,且因其HER2表达阴性而无法应用曲妥珠单抗等靶向治疗药物[1-2]。因此探讨TNBC发生发展的分子机制,寻找有效的TNBC治疗靶点已成为目前乳腺癌研究领域的热点。

miRNA是一类具有转录后调节功能的单链RNA分子,其异常表达在肿瘤发生过程中发挥重要作用[3]。miR-27a作为一种致癌因子在多种实体肿瘤中表达升高,并能够促进肿瘤细胞增殖和侵袭[4-5]。研究[4,6]发现,miR-27a在乳腺癌组织中高表达,其通过抑制锌指蛋白ZBTB10(zinefinger and BTB domain containing 10)、泛素连接酶FBW7(F-box and WD repeat domain-containing 7,FBW7)等蛋白表达促进乳腺癌细胞的增殖和侵袭。FBW7是泛素-蛋白酶体系统中的一种重要蛋白,可通过介导多种肿瘤相关蛋白,如Egl 9同源物2(Egl nine homolog 2,EGLN2)泛素化发挥抑癌作用[7]。EGLN2又名脯氨酸羟基化酶1(proly hydroxylase 1,PHD1),具有在特定环境下调控缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)的作用[8]。EGLN2在乳腺癌中的表达升高,并促进乳腺癌细胞系的增殖及耐药[9]。本研究通过实验检测miR-27a表达对TNBC细胞的增殖、迁移与侵袭的影响,并阐释其调控的分子机制,以期为TNBC的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 临床标本和细胞株

选取2017年1月—2018年12月皖南医学院弋矶山医院甲乳外科行乳腺癌改良根治术的TNBC新鲜组织标本68例,经常规病理学检查明确为非特殊类型的浸润性导管癌,且免疫组织化学法染色ER、PR、HER2均为阴性。于距离肿瘤边缘3 cm以上处取正常乳腺组织作为癌旁组织对照,标本收集后保存于液氮中备用。收集患者基本临床资料,包括年龄、是否绝经、肿瘤最大直径、肿瘤组织学分级、肿瘤临床分期、增殖细胞核抗原Ki-67指数、有无淋巴结转移等。采用2012版WHO乳腺癌肿瘤组织学分级将乳腺癌分为Ⅰ级(高分化)、Ⅱ级(中分化)、Ⅲ级(低分化),肿瘤临床分期采用TNM分期将乳腺癌分为Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期。根据荧光定量PCR结果,miR-27a表达较癌旁组织升高大于等于50%列为miR-27a高表达组,miR-27a表达较癌旁组织不升高或升高小于50%列为miR-27a低表达组。所有患者术前均未行放射治疗和化学治疗。本研究经皖南医学院弋矶山医院伦理委员会批准,所有患者均签署知情同意书。人转移性TNBC细胞系MDA-MB-453以及人正常乳腺上皮细胞MCF-10A均购自中国科学院细胞库。

1.2 主要试剂

RPMI-1640培养基、DMEM高糖培养基、胎牛血清、0.25%胰酶细胞消化液均购自美国Gibco公司,miR-27a抑制物及其对照购自上海吉玛公司,转染试剂Lipofectamine 3000、总RNA抽提试剂TRIzol购自美国ThermoFisher公司,SYBR Green荧光定量PCR试剂盒、miR-27a及U6引物购自日本TaKaRa公司,IPA裂解液、蛋白酶抑制剂PMSF、BCA蛋白浓度检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、CCK-8试剂及凋亡检测试剂盒均购自碧云天生物技术研究所,Transwell小室购自美国Corning公司,Matrigel基底膜基质胶购自美国BD公司,FBW7、EGLN2、β- 肌动蛋白(β-actin)抗体及二抗购自美国Abcam公司。

1.3 细胞培养

TNBC细胞MDA-MB-453采用RPMI-1640培养基培养,MCF-10A细胞采用DMEM高糖培养基培养。培养基均加入10%胎牛血清、100 U/L青霉素和100 U/L链霉素,培养箱条件为37 ℃、95%饱和湿度及5% CO2。根据细胞生长状态2~3 d换液1次。细胞生长至70%融合时,0.25%胰酶细胞消化液消化传代,取第3代对数生长期细胞用于后续实验。

1.4 实时荧光定量PCR检测miR-27a表达

采用TRIzol-氯仿提取组织及细胞总RNA,将mRNA反转录为cDNA。SYBR Green荧光定量PCR试剂盒检测miR-27a表达,以U6为内参基因,采用2-ΔΔCT计算目的基因的相对定量结果。miR-27a上、下游引物序列[10]分 别 为 5'-CGGCGGTTTCACAGTGGCTAAG-3'和5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3';U6上、下游引物序列分别为5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'和5'-AACGCTT CACGAATTTGCGT-3'。

1.5 细胞转染

取对数生长期细胞接种于6孔板,使用Lipofectamine 3 000转染试剂,参考说明书分别向MDA-MB-453细胞转染miR-27a抑制物(miR-27a inhibitor组)和miR-27a阴性对照片段(NC组),未转染组作为空白对照(control组)。荧光显微镜下检查转染效率,转染成功后培养板置37 ℃培养箱继续培养,48 h后收集细胞进行后续实验。miR-27a抑制物序列为5'-GCGGAACUUAGCCCACUGUGAA-3'。

1.6 CCK-8实验检测细胞增殖能力

收集转染48 h后的细胞接种于96孔板中,每孔接种2×104细胞,分别在接种后1、2、3、4、5 d,采用CCK-8法检测细胞活性。直接向每孔加入10 μL的CCK-8试剂,37 ℃培养箱中避光孵育30 min,酶标仪上测定450 nm处吸光度值[D(450 nm)],根据吸光度值计算各组细胞生存率。

1.7 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力

收集各组对数生长期细胞,采用无血清RPMI-1640培养基重悬细胞后接种于Transwell上室,每组设置5个复孔,每室接种100 μL密度为2.5×105/mL的细胞悬液。其中迁移实验直接使用未处理的Transwell小室,侵袭实验采用包被Matrigel基质胶的Transwell小室。下室加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,37 ℃培养箱中培养24 h。4%多聚甲醛固定后,结晶紫染色,高倍镜下计数穿膜细胞数。

1.8 蛋白质印迹法检测FBW7和EGLN2蛋白表达

细胞裂解法提取各组细胞总蛋白,BCA法检测蛋白质浓度,并行蛋白质印迹法(Western blotting)检测。于SDSPAGE蛋白电泳结束后转膜,5%脱脂奶粉封闭3 h,加入一抗,4 ℃封闭过夜,次日洗膜后加入二抗,37 ℃孵育1 h。洗膜后加入化学发光底物,凝胶成像系统扫描成像。以β-actin作为内参照,分析所得条带灰度值,计算蛋白相对含量。

1.9 统计学分析

应用SPSS 13.0和Graphpad Prism 8.0软件进行数据分析和作图。定量资料用±s表示,组间比较采用t检验;定性资料用频数和百分比表示,组间比较采用χ2检验。P<0.05认为差异有统计学意义。所有实验至少进行3次独立重复实验。

2 结果

2.1 miR-27a表达与TNBC患者临床特征的关系

通过分析miR-27a表达与TNBC患者临床特征的关系,发现miR-27a表达与患者组织学分级、临床分期、淋巴结转移以及肿瘤最大直径相关(均P<0.05);而与患者年龄、是否绝经以及Ki-67指数无明显相关性(表 1)。

表1 不同miR-27a表达水平的TNBC患者临床特征比较[n(%)]Tab 1 Comparison of clinical characteristics of TNBC patients with different levels of miR-27a expression [n (%)]

2.2 miR-27a在TNBC组织及MDA-MB-453细胞系中的表达

实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测结果显示,TNBC组织中miR-27a表达明显高于癌旁组织(P=0.039)(图1A),miR-27a在TNBC细胞系MDAMB-453中表达显著高于正常乳腺上皮细胞MCF-10A(P=0.015)(图 1B)。

图1 qPCR检测miR-27a在TNBC组织及细胞系中的表达水平Fig 1 Expression of miR-27a in TNBC tissues and TNBC cell line detected by qPCR

2.3 MDA-MB-453细胞系中miR-27a干预实验

MDA-MB-453细胞转染miR-27a抑制物后48 h,细胞内miR-27a含量与NC组相比显著下降(P=0.041),而NC组细胞miR-27a含量与control组相比差异无统计学意义(图2A)。Western blotting实验结果显示,转染miR-27a抑制物后,细胞内FBW7蛋白表达显著上升,而EGLN2蛋白表达明显下降(均P<0.05)(图2B)。这表明抑制TNBC细胞中miR-27a表达可以上调FBW7蛋白质表达,同时抑制EGLN2蛋白表达。

图2 转染miR-27a抑制物对MDA-MB-453细胞miR-27a表达以及FBW7、EGLN2蛋白表达的影响Fig 2 Effect of transfection of miR-27a inhibitor on miR-27a, FBW7 and EGLN2 expression in MDA-MB-453 cells

2.4 转染miR-27a抑制物对MDA-MB-453细胞增殖的影响

CCK-8检测结果,在接种后3、4和5 d,miR-27a inhibitor组细胞增殖活性较NC组明显降低(均P<0.05);而在各检测时间点,NC组与control组,增殖活性差异无统计学意义(图3)。表明下调MDA-MB-453细胞中miR-27a表达可显著抑制细胞增殖能力。

图3 下调miR-27a表达对MDA-MB-453细胞增殖能力的影响Fig 3 Effect of miR-27a down-regulation on the proliferation of MDA-MB-453 cells

2.5 转染miR-27a抑制物对MDA-MB-453细胞迁移和侵袭的影响

Transwell迁移实验结果显示,转染miR-27a抑制物48 h后穿膜细胞数明显少于NC组(P<0.05),而NC组与control组相比穿膜细胞数无明显差异(图4A);同样,Transwell侵袭实验呈现出一致的结果(图4B)。表明下调miR-27a表达可抑制TNBC细胞MDA-MB-453的迁移和侵袭能力。

图4 下调miR-27a表达对MDA-MB-453细胞迁移和侵袭的影响(×400,结晶紫染色)Fig 4 Effect of miR-27a down-regulation on the migration and invasion of MDA-MB-453 cells (×400, crystal violet staining)

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率在全球范围内逐年增高,研究乳腺癌发病的分子机制成为世界普遍关注的热点。TNBC作为一种特殊类型的乳腺癌,有发病年龄低、家族史明显、恶性程度高、淋巴结转移率和复发率高等特点[11-12],其发生、发展机制更加值得关注。

miR-27a作为一种致癌因子已被发现在多种实体肿瘤中表达升高,并且与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭密切相关。Xia等[13]研究发现,胰腺癌细胞中miR-27a呈高表达,而下调miR-27a表达能够显著抑制胰腺癌细胞系的增殖和侵袭能力。最近的研究发现,miR-27a参与调控乳腺癌细胞的增殖和侵袭。如miR-27a能够通过特异性地调控FBW7蛋白促进乳腺癌细胞发生上皮间质转化[14];此外miR-27a可直接上调转录因子SP1,促进肿瘤细胞G1/S期转换,导致乳腺癌细胞异常增殖,而下调miR-27a能够显著抑制乳腺癌细胞增殖[15]。本研究在TNBC组织中检测发现miR-27a表达升高,并且miR-27a表达与TNBC患者组织学分级、临床分期、淋巴结转移以及肿瘤最大直径相关,差异具有统计学意义。此外,在TNBC细胞株MDAMB-453中同样发现miR-27a高表达;进一步转染miR-27a抑制物下调miR-27a表达,并检测细胞增殖、迁移和侵袭能力。实验结果显示,miR-27a inhibitor组细胞在接种后3、4和5 d的细胞增殖活性明显低于NC组,并且Transwell迁移和侵袭实验中miR-27a inhibitor组穿膜细胞数均显著少于NC组。证实了下调miR-27a可抑制TNBC细胞MDA-MB-453的增殖、迁移和侵袭。

近年来有研究[7]发现,在TNBC细胞中FBW7表达缺失,这一缺失导致EGLN2蛋白升高并与肿瘤细胞的生长和转移相关。FBW7是一种泛素连接酶,其基因在多种肿瘤包括直肠癌、胃癌、卵巢癌和乳腺癌中存在着突变或缺失。FBW7可直接结合和靶向作用多种转录激活因子或原癌基因并对其进行泛素化修饰[16],诱导靶蛋白水解,从而调控肿瘤细胞的增殖与凋亡[17]。为进一步明确miR-27a对TNBC细胞生物学功能影响的分子机制,本实验对各组细胞FBW7以及EGLN2蛋白表达进行了检测。结果显示,与NC组相比下调miR-27a表达导致MAD-MB-453细胞中FBW7表达上升,而EGLN2蛋白表达显著下降。已有研究[18-20]证实miR-27a可负向调控FBW7蛋白表达,与本实验结果一致。综上所述,在TNBC细胞MDA-MB-453中下调miR-27a表达可显著抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭,并可能与FBW7介导的EGLN2蛋白泛素化密切相关。

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