新型冠状病毒（SARS-CoV-2）传播的溯源分析及启示

上海交通大学农业与生物学院，上海市兽医生物技术重点实验室，上海200240

自2019年12月，我国湖北省武汉市持续报告了越来越多的新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）病例[1-6]。世界卫生组织（WHO）将该新型冠状病毒临时命名为2019-nCoV（2019 novel coronavirus）。2020年2月11日，国际病毒分类委员会的冠状病毒研究小组在预印本平台BioRxiv发布称，将该病毒命名为severe acute respiratory syndrome coronavirus 2（SARS-CoV-2）[7]。

SARS-CoV-2主要通过呼吸道飞沫和接触传播，具有跨种间感染、人际间传播快等特征。COVID-19疫情来势急骤，在国际上引起了广泛关注。截至2020年2月27日，SARS-CoV-2已在亚洲、欧洲、美洲、非洲近40个国家造成约80 000人感染，超过2 700人死亡[8]。COVID-19疫情在中国已得到较好的控制，但韩国、日本、伊朗、意大利等国的疫情依然呈快速增长趋势。同时，一些重要的科学问题，如无临床症状感染者的发现、隔离和治疗，SARS-CoV-2传播的中间宿主及其在人畜之间的传播模式、变异规律等尚需要深入研究。

根据GenBank数据库[9]和GISAID数据库[10]公布的SARS-CoV-2的基因序列，研究[11-12]证实，SARS-CoV-2与严重急性呼吸综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERSCoV）一样，均为正链单股RNA病毒，同属于β属的冠状病毒（coronavirus，CoV）。

事实上，CoV可在人类、其他哺乳动物和鸟类中广泛传播，导致呼吸系统、消化系统和神经系统疾病。目前已知有6种CoV可导致人类疾病，其中CoV-229E、CoV-OC43、CoV-NL63和CoV-HKU1在人群中普遍流行，通常引起普通感冒；而SARS-CoV和MERS-CoV的致死率较高，对人类危害严重[13]。此次，新发现的SARS-CoV-2则可导致患者发生重症肺炎甚至致死。这3种高致病性CoV首次在人类中发现时，即有相关研究[14-18]证明这些病毒在动物体内早有储存。蝙蝠是大量CoV的自然储库，SARS-CoV和MERS-CoV均是由蝙蝠经过中间宿主，突破物种屏障，传播至人类[15]。

SARS-CoV-2初始是否同样来自蝙蝠？从源头宿主到感染人类过程中，哪些动物充当了传播媒介的角色？解答这个问题可以客观认识SARS-CoV-2感染的发生和发展。虽然目前确定SARS-CoV-2的动物（中间）宿主可能不会明确影响疫情暴发的进程，但是对未来进一步防止SARSCoV-2的扩散、控制疫情再次暴发、保障社会公共卫生安全具有重要意义。

1 蝙蝠与SARS-CoV-2

蝙蝠已被确定是多种病毒的天然宿主，包括肝炎病毒[尼帕病毒（Nipah virus，NiV）和亨德拉病毒（Hendra virus，HeV）]、CoV [SARS-CoV、MERS-CoV和猪急性腹泻综合征CoV（swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV）]等（传播方式见图1）和线状病毒[马尔堡病毒、埃博拉病毒（Ebola virus，EBoV）和勐腊病毒][19-22]。在其他哺乳动物物种中识别到的大量CoV也与蝙蝠CoV具有共同的祖先[23]。蝙蝠在飞行过程中的新陈代谢速率显著高于其他哺乳动物在运动中的新陈代谢速率[24]。研究[25]发现，高体温会提高哺乳动物先天性和适应性免疫系统多种免疫反应的速度，如高代谢率品系小鼠相比低代谢率品系小鼠会产生更多的白细胞和特异性IgM，发生更强的免疫反应[26]。蝙蝠在飞行中高新陈代谢率导致的体温升高可能是其对病毒免疫的机制之一[27]。

图1 感染人的不同CoVs的传播方式Fig 1 Different transmission modes of human-infecting CoVs

刺突蛋白（spike，S）和核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，NP）是CoV的2个重要结构蛋白。其中，S蛋白含有2个亚基，即S1和S2。S1主要包含受体结合区（receptor binding domain，RBD），负责识别细胞的受体；S2含有细胞膜融合过程所需的基本元件。基因组测序表明，所有蝙蝠的SARS相关CoV（severe acute respiratory syndrome-related coronavirus，SARSr-CoV）的基因组与从人或果子狸中分离出的SARS-CoV具有88%～92%的相似性[28]。CoV最大可变区位于S蛋白编码基因的5'末端，该区域编码负责受体结合的S1域，并位于紧靠NP蛋白编码基因上游的开放阅读框10区域中。在2002—2003年SARS疫情暴发后期，从人类分离出的大量的SARS-CoV在该区域中有29个核苷酸缺失[29]；但在SARS暴发早期，从果子狸或人类分离的SARS毒株和蝙蝠SARSr-CoV均不存在这种缺失[29]，这也是SARS-CoV和蝙蝠SARSr-CoV具有共同的祖先的依据之一。

2020年1月21日，中国科学院上海巴斯德研究所Xu等[30]比较了SARS-CoV与SARS-CoV-2的S蛋白结构，发现虽然后者RBD结构域中的4个关键氨基酸被替换，但结构并没有发生变化，二者RBD结构域的3D结构几乎相同；该研究推测，SARS-CoV-2的自然宿主可能与SARS-CoV一样，均为蝙蝠。

2020年1月23日，中国科学院武汉病毒研究所Zhou等[16]通过基因序列比对发现，SARS-CoV-2与SARS-CoV有79.5%的基因序列相似；与此前在云南菊头蝠上检测到的蝙蝠CoV（RaTG13）相比较具有96.2%的一致性；该研究揭示，SARS-CoV-2与SARS-CoV使用相同的受体血管紧张素转化酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）进入细胞；继而推测，SARS-CoV-2可能与SARSCoV一样，其自然宿主均为蝙蝠。随后，有更多研究[31-34]推测都倾向于这一结论。

但蝙蝠一般生活在遥远的山洞里，其携带的病毒在正常条件下不能直接感染人类。中间宿主可能是周边与人类有频繁接触的野生/半野生动物甚至家养动物。通过中间宿主环节可能促进病毒的重组和突变，进而扩大其遗传多样性，增加感染人类的危险性。事实上，对于SARSCoV-2来源的探究一直在持续进行中。

2 SARS-CoV-2何时何地从何种动物感染人群引起疫情暴发？

SARS流行病学研究[35]表明，SARS早期报告的患者比晚期报告的患者更多居住在农产品市场附近，并且其中近一半感染者是接触动物的从业人员。从市场上的动物（果子狸和貉）中分离出的SARSr-CoV 与人类分离的病毒株几乎相同[14]。人在SARS-CoV流行早期的病毒分离株与动物SARS-rCoV的关系更密切[36]。与SARS的暴发类似，武汉华南海鲜市场（简称海鲜市场）与SARS-CoV-2引发的疫情有着一定的联系。

2020年1月26 中国疾病预防控制中心对海鲜市场的585份环境样本进行了检测，其中33份样品检出SARS-CoV-2核酸，并推测SARS-CoV-2的来源是海鲜市场销售的野生动物。但在1月29日和30日发表在Lancet的2篇论文[4,37]亦表明，一些患者并未接触过海鲜市场，推测海鲜市场并不是早期感染者的唯一来源。

综合文献[30-31]和公开数据，推测SARS-CoV-2的传染源头至少存在2种可能性：①病毒的源头在海鲜市场并向外溢出扩散，即由于一些感染者并没有表现严重的症状，因而在未隔离治疗的情况下向他人传播病毒。②病毒在进入海鲜市场之前就已经开始流行，即病毒在海鲜市场以外的场所通过被感染的无症状动物，甚至是无症状感染者从外部带入海鲜市场。

事实上，海鲜市场中通过现杀现卖方式销售的动物种类较多，如竹鼠、水貂、穿山甲、蛇、獾等，其大多经过人工批量饲养后进行出售；该半野生状态的动物在规模养殖过程中饲养密度高，病毒传播可形成接力，进而积累变异。然而天然野生动物由于没有这么高的居住密度，病毒很难接力下去，这也解释了为何在东南亚一带人们也有食用野生动物的习惯却没有更早引起SARS-CoV或SARSCoV-2的传播。由此推测：SARS-CoV-2可能来自养殖场的半野生状态的动物，其可能被源头宿主（如蝙蝠或啮齿类）携带的病毒污染成为中间宿主，并在拥挤潮湿的海鲜市场环境中进一步促进病毒大量增殖。根据网络上的照片，海鲜市场中活动物生存空间狭小且拥挤，卫生条件较差，高压水龙头的喷撒使得动物暴露在持续应激环境中。此外，动物剖杀产生的血肉残渣会吸引流浪犬、流浪猫和家鼠等，从而可能使它们被感染。不同种属的动物之间的交叉感染以及病毒的重组或变异，可能在某个时间点跨种传播到达人类从而引起疫情暴发。

推测第一批人类感染可能在2019年11月或更早的时间发生，且病毒通过宿主动物在2019年12月之前就进入海鲜市场并传染给人类。被感染者症状可能不明显，所以在不知情的情况下把病毒传给了其他与海鲜市场无直接关系的人。Li等[38]分析了SARS-CoV-2的遗传多样性、时间起源和进化史，推测SARS-CoV-2感染可能于2019年11月初起源于武汉（95%CI2019年9月25日—2019年12月19日）。这与Andersen等[39]对SARS-CoV-2基因组进化分析的结果一致。此外，蝙蝠一般都有冬眠的习性（9—10月期间），如果SARS-CoV-2初始源自蝙蝠则极有可能在11月之前已开始在某些动物中传播。

3 SARS-CoV-2的中间宿主研究进展

文献[19]表明，感染人的CoV常见中间宿主有果子狸、猪、骆驼、羊和牛。在SARS疫情后，研究[14,40]发现狸、貉、猫和雪貂均可以携带和传播CoV。

2020年1月22日北京大学、广西中医药大学、宁波大学等单位联合发文，指出蛇是造成SARS-CoV-2感染暴发最可能的野生动物[12]。该研究比较了SARS-CoV-2所青睐的密码子与潜在宿主（包括刺猬、穿山甲、蝙蝠、鸡、人类和蛇）所偏爱的密码子发现，SARS-CoV-2对密码子的选择与银环蛇和中华眼镜蛇使用的密码子最相似。但蛇是中间宿主的提法一经发布便遭到质疑[41]。迄今，尚无证据指出β属的CoV存在于哺乳动物和鸟类以外的宿主体内。

2020年1月24日，北京大学Guo等[42]使用基于深度学习算法开发的病毒宿主预测（virus host prediction，VHP）方法预测了蝙蝠和水貂可能是SARS-CoV-2的2个潜在宿主，其中水貂可能为中间宿主。该研究指出与其他CoV相比，蝙蝠SARSr-CoV与SARS-CoV-2具有更相似的感染模式；通过比较不同脊椎动物的病毒感染模式，发现水貂的病毒感染模式更接近蝙蝠。

2020年2月20日，华南农业大学Xiao等[17]在BioRxiv上发表的研究结果揭示穿山甲是SARS-CoV-2的潜在中间宿主。该团队对穿山甲样品（2019年采集）进行病毒组学检测，结果显示从马来亚穿山甲中分离出的一种CoV在编码小包膜糖蛋白、膜糖蛋白、NP蛋白和S蛋白的基因中分别与SARS-CoV-2表现出100.0%、98.2%、96.7%和90.4%的氨基酸同源性。2020年2月18日，香港大学管轶团队与广西医科大学胡艳玲团队合作在BioRxiv上发表研究[18]，发现并鉴定了早期的穿山甲样本（2017—2018年采集）中存在与SARS-CoV-2基因组相似率在 85.5%～92.4%的CoV。上述2个研究同时表明，穿山甲很可能是SARS-CoV-2从蝙蝠到人类的中间宿主；继而提示在自然条件下，与SARS-CoV-2相关的CoV在穿山甲体内早有储存。

4 不容忽视的其他动物

由于CoV宿主广泛的特点以及自身基因组的结构特征，使其在进化过程中极易发生基因重组和变异，呈现遗传多样性。新亚型及新的CoV在此过程中不断出现，使该病毒可发生跨种属感染，也对感染的预防与治疗带来较大的困难[43-44]。CoV在许多家畜和野生哺乳动物中被发现，如狗、猫、猪、鲸和羊驼[45-48]。

流行病学研究[35]发现，最初的SARS患者有宠物接触史。血清流行病学研究[49]也表明，未感染SARS的动物售卖商血清中SARS-CoV IgG的抗体阳性率高于一般人群。王玉燕[50]检测了全国各地138份犬粪样本，发现腹泻病犬中感染犬CoV的比例从40.9%～100.0%不等。有研究[51-52]发现，上海及周边地区犬感染犬CoV很常见，发病率与季节有关，秋冬季发病率较高。

CoV在鼠类中广泛存在，且鼠是感染人的CoV常见初始宿主[53]。研究[53]发现，SARS-CoV-2不同于SARS-CoV，在感染方式上与具有第Ⅰ类膜融合蛋白的鼠肝炎CoV更为接近。

中国科学院武汉病毒研究所2018年4月发现一种对养殖场仔猪致命的SADS-CoV，并进一步研究证实该病毒的源头是中华菊头蝠[54]。研究[55-56]表明，SADS-CoV存在广泛跨物种传播特征，即该病毒在体外具有广泛的宿主嗜性，可感染多种啮齿类动物（大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠）的细胞系。因此，推测在野外和猪场的啮齿类动物可能是潜在的长期病毒携带者（图2）。

图2 啮齿类动物可能为潜在的长期SADS-CoV携带者Fig 2 Rodents may act as potential long-term SADS-CoV carriers

受体的表达和分布决定了病毒感染的途径，而了解病毒的感染途径对于理解发病机制和设计治疗策略具有重要意义。细胞实验证实，SARS-CoV-2进入细胞需要ACE2的存在。SARS-CoV-2与SARS-CoV拥有相同的受体ACE2[34,37,57]。事实上，ACE2蛋白广泛存在于各种人体器官（包括口腔、鼻黏膜、鼻咽、肺、胃、小肠、结肠等）中；ACE2蛋白尤其在Ⅱ型肺泡上皮细胞和小肠上皮细胞表面表达量较高。此外，ACE2存在于所有研究器官的动脉和静脉内皮细胞及动脉平滑肌细胞中。总之，ACE2在肺和小肠上皮细胞中大量存在，这为SARS-CoV提供了可能的进入途径[58]。

基于公共数据库和单细胞转录组测序（single-cell RNA-seq，scRNA-seq）技术，同济大学等机构的研究人员分析了正常人类肺部ACE2的RNA表达谱[57]。结果表明，其与早期研究[59]一致，ACE2病毒受体的表达集中在少量的Ⅱ型肺泡细胞中。scRNA-seq技术再次证实，结肠和回肠中（特别是有吸收功能的肠上皮细胞）表达ACE2的细胞数量明显比肺部中的多[60]，这可能解释了SARSCoV-2感染导致的腹泻症状。而在食管中，ACE2主要表达于上皮和复层上皮细胞，这可能与食管和气管在细胞类型上的起源有关。这也意味着，SARS-CoV-2具有完整的入侵线路和新的传播途径。

ACE2蛋白不仅存在于人类肺和肠道等器官，还普遍存在于其他哺乳动物中。在果子狸和中国马蹄蝠中，表达的ACE2可以帮助多种CoV（如SARSr-CoV、SARSCoV-2）进入细胞[16,61-63]。研究[64-65]证实，雪貂和貉等存在的ACE2可以作为SARS-CoV S蛋白的有效受体。

有必要进一步深入了解ACE2在不同动物组织和细胞中的分布，这对于开展相应的动物筛查非常重要。我们利用MEGA 5软件构建了20个不同ACE2全基因组的系统发育树，将犬、猫、鼠、人、黑猩猩、果子狸、水貂、猪和牛等动物进行了比较。每一个蛋白均以GenBank登录号/NCBI 参考序列（RefSeq）号 - 动物名表示。进化树分析表明，人和黑猩猩的ACE2蛋白聚集在一个亚群，犬、猫、果子狸和水貂的ACE2蛋白聚集在一个亚群，猪和牛的ACE2蛋白聚集在一个亚群，而鼠的ACE2蛋白单独聚集在一个亚群（图3）；目前，不同物种ACE2全基因组的系统进化关系是否与该物种易感并成为SARS-CoV-2的中间宿主，还需进一步验证。

综上，推测SARS-CoV-2可能存在多个中间宿主。与人类接触频繁的半野生状态的动物以及居无定所的流浪犬、猫和家鼠均有可能成为SARS-CoV-2的中间宿主。要回答这一科学问题，应从生物信息学、免疫学、分子流行病学、病毒传播模式学等方面进行分析的同时，用病毒组学、反转录聚合酶链反应以及酶联免疫吸附测定等方法进行验证，才能得出确定的答案。

5 诸多可能中间宿主带给我们的启示

尽管尚未确认SARS-CoV-2的来源，但目前的研究[66-67]初步表明蝙蝠起源的可能性很高。在过去25年中，已证实或疑似由蝙蝠传播的病毒引起了多起重要的新发传染病疫情，包括1994年发现的HeV[68]、1998—1999年发现的NiV[69]、2002—2003年发现的 SARS-CoV[70]、2012年发现的MERS-CoV[71]以及2014年发现的EBoV[72]。所谓的新发人兽共患病，有些病原往往早已存在于动物宿主中。恰恰是人类和动物的聚集与流动促进了新病暴发，甚至老病复燃。动物的规模化养殖以及养殖过程中对动物福利理念和实践的忽视，活动物（特别是野生动物）交易市场的存在及其拥挤潮湿的条件，为加速病毒增殖、重组和传播创造了条件。人和动物的频繁流动，也促进了病毒的扩散速度。考虑到这些，在COVID-19疫情暴发的背景下，重要的是要反思之前得到的经验和教训。

在疫情暴发的应对中，采用“同一健康（One Health）”方法至关重要。人的健康与动物和环境的健康息息相关。部分地区为谋求经济发展对生态系统的破坏，导致人和野生动物的接触机会增加，病原体被野生动物从疫源地携至人类社会，引发传染病流行的概率也随之增加[73]。据WHO资料[74]显示，近年来75%新发传染病为人兽共患病。新发和再发人兽共患病的传播，严重威胁人类健康，给社会造成重大经济损失。伴随着全球人员流动，区域性传染病发展成为全球大流行的概率则越来越大。

SARS-CoV-2的来源尚不确定，需要对多种可能的中间宿主进行监测。同时，还需思考和探究SARS-CoV-2来源的去向。病毒从野外天然宿主（如蝙蝠或鼠类）通过中间媒介进入人类生活环境，引发大规模疫情暴发后，可能存在2种结局：第一，完全退出人类生活环境；第二，可能存在于人类体内或与人类接触密切的动物（储存宿主）体内，在环境因素作用下病毒可能持续进化。在隔离感染者的同时，还需确定周边的哺乳动物是否存在感染情况。此外，无症状的隐性感染者多为动物密切接触者或动物从业人群，对这类高危人群进行血清学监测也十分必要。公共卫生专业人员、动物医学科技工作者甚至动物从业者之间更应当加强有效的交流与合作，通过共享疾病信息、共同开展疾病流行病学分析和风险评估，秉承同一地球、One Health理念，携手共同应对新形势下公共卫生新挑战。

WHO曾在SARS疫情结束后组织调查SARS病毒的起源和早期传播，被邀请的8位国际专家中，有7位是兽医或从事动物卫生工作的专家；相比之下，中国由6人组成的团队只有1名动物医学专家[75]。

在本次COVID-19疫情的应对中中国做出了巨大努力，但动物流行病学专家和兽医的参与似乎仍不够，可能是导致寻找中间宿主尚未成功的原因之一。目前，我们迫切需要了解哪些动物作为中间宿主参与SARS-CoV-2的跨种间传播以及将来可以采取哪些措施以降低传播风险。特别要关注，是否可能在家畜、流浪动物以及家鼠中形成新的储存宿主？国家依法坚决取缔野生动物交易是明智与及时的举措，进一步所有活动物交易都应被取缔。同时，改善规模化饲养动物的生存条件，关心动物福利，合理安置流浪犬、猫，对预防传染病暴发也是至关重要的。我们建议，组织一支全面、专业的One Health团队参与未来的新发人兽共患病调查，制定更合理的预防措施，以期起到更好的防控效果。

One Health理念注重人类、动物和环境健康间的关联性，强调跨学科、跨部门、跨区域的合作，已经得到许多国家和国际机构、组织的拥护和支持，并被成功地实践和应用于疾病防控方面取得了显著成效[76]。现在是全球卫生界应该吸取教训的时候。人畜共患疾病的暴发几乎肯定会再次发生，COVID-19疫情带来的教训绝非中国独有。在COVID-19以及未来可能暴发的传染病防控过程中引入One Health理念，发挥动物流行病学在公共卫生安全中的预警作用，加强人类医学-动物医学一体化防控体系建议，对于控制新发人兽共患病以及实现人类、动物和环境的和谐与健康具有深远的意义。

致谢 衷心感谢上海交通大学人兽共患病与比较医学课题组华修国教授、蔺智兵博士后在论文写作过程中给予的思路启迪和修改建议，以及赵婷婷博士在制作示意图中的热心帮助。