土大黄内生真菌L10的培养条件优化

卢甜甜，郑双芝，柴家乐，李晓菡，陈怡怡，吴丹丹，白雪莲

（杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州 310016）

土大黄，别名红筋大黄、金不换、血三七、化雪莲、鲜大青，为蓼科酸模属植物，主要分布在我国的浙江、四川、贵州、江苏、福建、湖南等地。根和叶可以入药，具有清热解毒、止血、祛瘀、通便、杀虫等功效。秋季挖根，洗净、切片，晒干或鲜用。10月份采叶，随用随采[1]。

内生菌是指在其生活史的一段或全部阶段，生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的微生物[2]。研究表明，内生菌与病原菌在植物体内相互竞争空间、营养，使病原菌得不到正常的营养供给而消亡，从而增强宿主抵御病害的能力[3]。

项目组前期从土大黄植株中分离获得86株内生菌，经抑菌活性筛选，发现内生菌L10代谢产物抑菌活性强，具有极大的开发应用价值，因此对土大黄内生真菌L10的培养条件进行优化，以期为今后深入研究土大黄内生真菌L10的代谢产物和大规模发酵奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株：土大黄内生真菌L10，杭州师范大学微生物实验室提供；马铃薯葡萄糖肉汤固体培养基（PDA）、马铃薯葡萄糖肉汤液体培养基（PDB）、盐酸、氢氧化钠，国药集团提供。

1.2 方法

1.2.1 菌体干质量测量方法

以菌体干质量为指标，即取1 mL菌液加入离心管，以转速8 000 r/min离心10 min，去掉上清液，菌体在105℃条件下烘至恒质量即为菌体干质量。

1.2.2 孢子悬浮液的制备

将内生真菌L10接种到PDA固体培养基上，于28℃下培养7 d，每个培养皿中分别加入2 mL无菌水，用无菌接种环轻轻刮取菌落表面，用移液器吸取培养基表面孢子悬液加入锥形瓶中，各培养皿在一个锥形瓶中混匀，备用。

1.2.3 单因素试验

（1）培养基初始pH值对菌体干质量的影响。在250 mL锥形瓶中接入3 mL孢子菌悬液，再加入97 mL PDB液体培养基，用盐酸溶液、氢氧化钠溶液分别调节 pH值至 5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，在 28℃，200 r/min摇床上培养7 d。

（2） 接种量对菌体干质量的影响。在250 mL锥形瓶中分别接入2.5，5.0，10.0，15.0，20.0 mL孢子菌悬液；再依次加入97.5，95.0，90.0，85.0，80.0 mL PDB液体培养基，pH值自然，在28℃，200 r/min摇床上培养7 d。

（3） 培养温度对菌体干质量的影响。在250 mL锥形瓶中接入3 mL孢子菌悬液，再加入97 mL PDB液体培养基，pH值自然，分别设置温度为15，20，25，30，35℃，在200 r/min摇床上培养7 d。

（4）装液量对菌体干质量的影响。在250 mL锥形瓶中分别接入1.5，3.0，4.5 mL孢子菌悬液，再依次加入48.5，97.0，145.5 mL PDB液体培养基，pH值自然，在28℃，200 r/min摇床上培养7 d。

1.2.4 Box-Behnken优化试验

在单因素试验的基础上，选择培养温度、接种量、装液量3个因素为主因子，按照Box-Behnken试验设计安排试验，以菌体干质量为评定指标。试验所得数据整理后，用Design Expert 10.0软件进行分析处理。

Box-Behnken试验设计因素与水平设计见表1。

2 结果与分析

2.1 培养条件对菌体生长的影响

2.1.1 培养基初始pH值对菌体生长的影响

菌种只有在适宜的pH值条件下才能良好生长，pH值过高或者过低都不利于菌种的生长。

培养基初始pH值对菌体生长的影响见图1。

由图1可知，菌体干质量随着初始pH值的升高呈先增大后减小的趋势。当pH值为7.0时，菌体干质量最大，达到2.58 g/L；当pH值达到7.5时，菌体的干质量下降为2.42 g/L；培养基的自然pH值是6.8，接近于pH值的最适值。所以，无需对培养基的pH值进行调整，即可达到较高的菌体生长水平。2.1.2 接种量对菌体生长的影响

接种量与菌体总量成正比，接种量越大，菌体的调整期越短，而菌体总量越大；但是，受培养基中营养物质和反应器体积的限制，分批培养能达到的菌体总量有限，接种量增大至一定程度时，不但对菌体生长无益，而且容易造成菌体的老化和自溶。

接种量对菌体生长的影响见图2。

由图2可知，从2.5%～10.0%，随着接种量的增加，菌体干质量从1.78 g/L到4.83 g/L逐渐增大；当接种量大于10.0%时，接种量继续增大对菌体生长无显著影响。

2.1.3 培养温度对菌体生长的影响

菌种生长有各自适宜的温度，超出这一范围将不利于菌种生长。

培养温度对菌体生长的影响见图3。

由图3可知，在30℃条件下，菌体干质量达到最大为2.17 g/L；在25℃条件下，菌体干质量与最大菌体干质量无显著差异；而在其他温度条件下，菌体干质量显著降低。因此25～30℃比较适宜菌种的生长。

2.1.4 装液量对菌体生长的影响装液量越大，则菌体生长所需的营养物质越多。装液量对菌体生长的影响见图4。

由图4可知，菌体干质量在装液量为100 mL时最大为2.1 g/L；在装液量为150 mL时，菌体干质量下降。

2.2 菌体生长条件的优化

根据单因素试验结果，采用Box-Behnken模型选择接种量X1、培养温度X2、装液量X3设计三因素三水平设计优化试验。

试验方案及结果见表2，回归模型的方差分析见表3。

表2 试验方案及结果

利用Design Expert 10.0统计软件对表2数据进行多元回归拟合，得到菌体干质量（Y）的多元回归模型为：

模型复相关系数R=0.994，决定系数R2=0.986 2，显著性检验表明回归模型极显著，各因素对Y均有显著影响（表3），模型有意义。模型中各因素的回归系数显著性检验结果（表3） 表明，接种量X1、培养温度X2、装液量X3对菌体干质量影响均为极显著，接种量与培养温度、接种量与装液量两两之间交互作用影响显著。

表3 回归模型的方差分析

利用复合函数极值法进一步分析表明，当X1=0.59，X2=0.08，X3=0.32，接种量为13%，培养温度为28℃，装液量为125 mL时，菌体干质量有最大预测值，为5.162 g/L。为验证模型的有效性，用优化得到的培养条件进行试验（重复3次），测得实际菌体干质量为5.126 g/L，与预测产量之间没有显著性差异，达到优化前培养条件（250 mL锥形瓶装液100 mL，接种量3%，培养温度28℃） 菌体干质量（约2.5 g/L） 的2.4倍。

3 结论

试验有效地优化了土大黄内生真菌L10的培养条件。在单因素试验的基础上，用Box-Behnken模型对土大黄内生真菌L10的液体培养条件进行了优化，菌体干质量从优化前的2.5 g/L提高到优化后的5.126 g/L，约为优化前2.4倍。

所得内生菌L10培养条件为其产生最佳代谢产物奠定了基础，其代谢产物的相关研究需进一步展开。此外，培养基组成对菌体生长影响很大，在此基础上还可以进一步优化培养基配方，使菌体生长代谢能力得到进一步提高。