白喉棒状杆菌在实验教学中的染色方法改良

陈剑煌，周红，黄锦桃，李美玉

（中山大学中山医学院病原生物学实验室，广东 广州 510008）

白喉棒状杆菌（Corynebacterium diphtheriae）是棒状杆菌属里最重要的对人类致病菌，需氧或兼性厌氧，致病时主要侵犯人的咽部形成灰白色假膜，俗称白喉，并能产生强烈的外毒素，扩散至多种器官中引起现变，严重时可引致死亡[1]。因此，在病原生物学实验教学中，白喉棒状杆菌是该属中唯一用作示教的病原体。该菌体细长、微弯曲，菌体一端或两端稍膨呈棒状，排列不规则，常呈L、V、Y形或呈栅栏状。该菌为革兰阳性菌，短时间染色时，菌体着色不均匀，易出现有浓染的颗粒，称为异染颗粒。异染颗粒主要成分是核糖核酸和多偏磷酸盐，在鉴定时有重要意义。

白喉棒状杆菌使用的染色方法有革兰染色法、美蓝染色法、Albert染色法、Neisser染色法等，其中以Neisser染色法使用的比较多[2]。用传统的Neisser染色法进行染色后，菌体可被染上淡褐色，并可见明显的深蓝色异染颗粒，如此制作出的示教玻片可用于实验教学，大多数情况下异染颗粒清晰易见，但菌体颜色偏淡，在光源光线偏强和偏弱时均不易看清菌体。玻片在1-2年后出现菌体染色变淡的现象，异染颗粒也在2-3年后相继褪色。本实验尝试对Neisser染色法进行改良，探索更稳定的染色方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 白喉棒状杆菌38101，来自中山大学中山医学院病原生物学实验室的菌毒种库，-80 ℃超低温保存。

1.1.2 培养基配制 将新鲜鸡蛋用肥皂水及清水洗净蛋壳，浸于75%酒精中30 min，取出以无菌纱布擦干，以无菌镊子在蛋壳气息尖端开一小孔，打开蛋壳，将全部蛋倒入盛有玻璃珠的无菌三角烧瓶内，充分摇匀。无菌量取蛋液300 mL加入灭菌生理盐水100 mL，混匀后用两层无菌纱布过滤。加入甘油4 mL，混匀分装中试管，每管4-5 mL，置血清凝固器内制成斜面，80-85 ℃加热30 min，采用间歇灭菌法，连续3 d。

1.1.3 染色液配制

1.1.3.1 俾斯麦褐液 取俾斯麦褐0.2 g溶于100 mL 100 ℃蒸馏水中，冷却后过滤。

1.1.3.2 奈瑟氏美蓝液：美蓝1 g研磨溶解于2 mL 95%酒精中，加冰醋酸5 mL及蒸馏水95 mL，混合，24 h后过滤。

1.2 方法

1.2.1 涂片 复苏菌株后接种于鸡蛋培养基斜面上，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。滴一滴生理盐水于载玻片上，以接种环从鸡蛋培养基上挑取少量菌体，在生理盐水中均匀涂布于载玻片上，等待干燥，置烤片机上60 ℃烤1 min。

1.2.2 染色 先以俾斯麦褐液染色1 min，蒸馏水冲洗，甩干。后以奈瑟氏美蓝液染色1.5 min，蒸馏水冲洗，甩干后油镜下观察。

2 结果

染色后的白喉棒状杆菌在油镜下可见菌体染成蓝色，形状清晰可见，细长、微弯曲，一端或两端稍膨大呈棒状，排列不规则，常呈L、V、Y、X形等形状。菌体着色不均匀，异染颗粒呈深蓝色。在大多数条件下菌体轮廓均可辨认。改良的染色方法制作的白喉棒状杆菌玻片标本在1年后放油镜下观察（图1）与传统Neisser染色法制作的玻片标本（图2）相比，能更好地保持菌体上的颜色。

3 讨论

本实验中通过将Neisser染色法中的A、B液调换顺序，经此改良后的染色法制作出来的白喉棒状杆菌玻片标本可改善菌体颜色不清晰的缺点，得到具有清晰边界的蓝色菌体，改进实验教学效果。玻片标本中的菌体和异染颗粒在1-2年后颜色仍然清晰未有褪色，可长期保存。

白喉棒状杆菌的染色结果与多种因素有关，如菌株差异、培养基情况、染色液的种类和新旧程度等[3]。本实验所使用的菌株为本实验室在实验教学中使用，经多年传代接种，与临床中流行的菌株差别较大，因此本方法对临床菌株的适用性有待进一步研究。